李達，沈雪蓮，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，耿介，王超男，白琛俊，張?zhí)?，董潔，邵寧?/p>

軍事醫(yī)學研究院 軍事認知與腦科學研究所，北京 100850

Ku蛋白是一種含量豐富的核蛋白，進化上高度保守，分布廣泛，從細菌到人類均有表達[1-2]。人Ku蛋白是異二聚體，由Ku70和Ku80兩個亞基組成。研究發(fā)現(xiàn)，Ku蛋白具有不同尋常的DNA結合特性，其以非序列依賴性的方式緊密結合在雙鏈DNA的斷端，是經(jīng)典非同源末端連接（classi?cal non-homologous end joining，C-NHEJ）途徑中的DNA末端結合因子，招募DNA依賴的蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）與其結合形成DNA依賴的蛋白激酶全酶，催化雙鏈斷裂DNA的修復[2-7]。

此外，Ku蛋白還可能參與其他重要的生物學過程，比如Ku蛋白被證實與染色體端粒結構的維持有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)在失去任意一個Ku蛋白亞基后，釀酒酵母就會出現(xiàn)端粒結構缺失的現(xiàn)象[8-9]。還有研究顯示Ku70與細胞凋亡有直接聯(lián)系，即Ku70能夠與促凋亡因子Bax結合，抑制其促進細胞凋亡的作用[10]。然而，Ku蛋白的生物學功能尚未得到完全闡釋，有待深入研究。

我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術破壞HeLa細胞Ku70基因開放讀框，同時在其中插入潮霉素B抗性基因，然后通過潮霉素B抗性篩選獲得Ku70基因穩(wěn)定敲除的HeLa細胞株，再進一步利用此細胞株研究Ku70蛋白的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細胞由本實驗室保存；pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro質粒由軍事醫(yī)學研究院鄭曉飛教授惠贈；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、T4DNA連接酶、細胞基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；PCR平末端產(chǎn)物加A試劑盒、pBackZero-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；pfuDNA聚合酶購自北京全式金生物技術公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、BsmBⅠ為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；PRIME jet轉染試劑為PolyPlus公司產(chǎn)品；潮霉素B為Roche公司產(chǎn)品；Ku70抗體購自Pro?teintech公司；GAPDH抗體購自中杉金橋公司；CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；2×SYBR Green Mix購自Toyobo公司；引物由生工生物技術公司合成。

1.2 構建pCas-gRNA質粒

用CRISPR DESIGN程序設計針對人Ku70基因的向導RNA（guide RNA，gRNA）序列（表1），合成編碼gRNA的DNA序列，退火形成雙鏈DNA。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、BsmBⅠ對pCas-guide載體和退火產(chǎn)物進行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物。將酶切后的pCas-guide載體和退火產(chǎn)物用T4DNA連接酶于20℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，涂布于氨芐西林（Amp）抗性的細菌培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取細菌單克隆，菌液PCR鑒定后選取陽性克隆測序。

表1 合成的引物序列

1.3 構建供體DNA質粒pBackZero-T-Ku70

以HeLa細胞基因組為模板，Ku70-F1/Ku70-R1為引物擴增Ku70左同源臂片段Ku70-L，以Ku70-F2/Ku70-R2為引物擴增Ku70右同源臂片段Ku70-R；以pSilencer2.1-U6hygro質粒為模板，Hy-F/Hy-R為引物擴增潮霉素B抗性基因片段Hy；瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收片段Ku70-L、Ku70-R和Hy。以片段Ku70-L、Hy為模板，Ku70-F1/Hy-R為引物，重疊PCR擴增出Ku70-LHy；再以Ku70-L-Hy和Ku70-R為模板，Ku70-F1/ Ku70-R2為引物，擴增獲得片段Ku70-KO，回收目的片段。用A-Tailing Kit在Ku70-KO片段平末端添加單個堿基A后，將該片段連接到pBackZero-T載體，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α并挑取單克隆菌株進行菌液PCR鑒定，選取陽性克隆測序。

1.4 細胞轉染、抗性篩選與鑒定

將HeLa細胞以3×105/mL的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長至30%～40%時轉染0.8 μg pCas-gRNA質粒和1.2 μg pBackZero-T-Ku70質粒，轉染后72 h收集細胞，以4×104/mL的密度接種至6孔板中，待細胞完全貼壁后加入潮霉素B（200 μg/mL），2～3 d更換一次含同濃度潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第7 d提取細胞基因組做PCR鑒定。以提取的細胞基因組為模板，Ku70左同源臂基因上的引物K-F和潮霉素B抗性基因上的引物K-R進行PCR擴增。之后將細胞擴大培養(yǎng)，凍存。

1.5 單克隆穩(wěn)定細胞株篩選與鑒定

用有限稀釋法篩選Ku70穩(wěn)定敲除的HeLa單克隆細胞株，胰酶消化細胞，以新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至10/mL，將稀釋的細胞懸液接種至96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)1周后顯微鏡下觀察，選取含單克隆細胞的孔進行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)至24孔板時改用含200 μg/mL潮霉素B的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，1周后收集細胞進行Western印跡鑒定。

1.6 Western免疫印跡實驗

收集細胞，用RIPA提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量，行12%SDS-PAGE，每泳道35 μg蛋白，然后濕轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗室溫孵育2 h，0.1%TBS-T洗3次；二抗室溫孵育1 h，0.1%TBS-T洗3次；ECL曝光顯影。

1.7 CCK-8法測定Ku70穩(wěn)定敲除細胞株的增殖能力

將處于對數(shù)生長期的Ku70穩(wěn)定敲除細胞和野生型HeLa細胞以3×104/mL的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別在0、24、48、72、96 h加入CCK8試劑，每孔10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后檢測D450nm值，制作細胞的96 h生長曲線。

1.8 Transwell方法檢測Ku70穩(wěn)定敲除細胞株的遷移能力

將處于對數(shù)生長期的Ku70穩(wěn)定敲除細胞和野生型HeLa細胞以2×105/mL的密度種于Tran?swell小室的上室，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后擦去未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛固定穿膜細胞，0.1%結晶紫染色后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 Ku70穩(wěn)定敲除細胞的miRNA表達水平檢測

用TRIzol法提取Ku70穩(wěn)定敲除細胞和野生型HeLa細胞的總RNA，取1 μg RNA反轉錄為cDNA。qPCR反應體系包括1 μL cDNA、1 μL引物（表1）、10 μL 2×qPCR SYBR Green mix、8 μL ddH2O。反應條件：預變性95℃ 10 min，變性95℃ 20 s，退火55℃ 20 s，延伸72℃ 20 s，50個循環(huán)，采集熔解曲線。用 StrataGene公司的Mx3000P qPCR儀檢測，Mx3000P軟件分析結果。

1.10 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3次以上，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計分析使用SAS 9.2軟件的Student'sttest，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 設計并構建pCas-gRNA質粒

用 CRISPR DESIGN程 序（http://crispr.mit. edu/）設計gRNA序列。選取Ku70編碼區(qū)100～300 bp序列輸入對話框，從輸出的結果中選擇合適的靶位點序列。為了防止脫靶，我們共設計了3條gRNA序列。將合成的gRNA互補鏈退火形成雙鏈，與雙酶切的線性化pCas-guide連接，獲得重組質粒pCas-gRNA。轉化鋪板后挑取單克隆菌落進行PCR鑒定，將陽性克隆測序（圖1），結果顯示3條gRNA序列均正確插入pCas-guide載體，pCasgRNA質粒構建成功。

圖1 pCas-gRNA質粒菌液PCR鑒定M：DNA marker；1～10：單克隆

2.2 構建供體DNA質粒pBackZero-T-Ku70

以HeLa細胞基因組為模板，分別以Ku70-F1/ Ku70-R1、Ku70-F2/Ku70-R2為引物，擴增長度分別為500和540 bp的Ku70左右同源臂Ku70-L、Ku70-R；以質粒pSilence2.1-U6 hygro為模板，Hy-F/Hy-R為引物，擴增長度為1026 bp的潮霉素抗性基因片段Hy；進而，以DNA片段Ku70-L、Hy為模板，Ku70-F1和Hy-R為引物，利用搭橋PCR擴增片段Ku70-L-Hy；再以Ku70-L-Hy和Ku70-R為模板，Ku70-F1和Ku70-R2為引物，擴增獲得2066 bp的Ku70同源臂供體DNA片段Ku70-KO。瓊脂糖凝膠切膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，在其末端添加單個堿基A，再將該片段連接到pBackZero-T載體上，菌液PCR鑒定重組菌，將陽性克隆測序（圖2），序列比對結果表明重組質粒序列正確，同源臂供體DNA載體pBackZero-TKu70構建成功。

圖2 pBackZero-T-Ku70質粒菌液PCR鑒定M：DNA marker；1～10：單克隆

2.3 篩選鑒定Ku70敲除的多克隆細胞株

將重組質粒pBackZero-T-Ku70分別與3種pCas-gRNA質粒共轉染HeLa細胞，72 h后加入終濃度為200 μg/mL的潮霉素進行抗性篩選，15 d后收集細胞，提取細胞總蛋白，Western印跡檢測Ku70蛋白的表達水平。結果顯示，與對照細胞相比，轉染質粒pCas-gRNA3的細胞Ku70條帶明顯減弱，提示gRNA3敲除效果最佳（圖3）。

圖3 Western印跡檢測多克隆細胞株中Ku70的表達1：未轉染的對照細胞；2：pBackZero-T-Ku70載體和pCas-gRNA1載體共轉染的細胞；3：pBackZero-T-Ku70載體和pCas-gRNA2載體共轉染的細胞；4～7：pBackZero-T-Ku70載體和pCas-gRNA3載體共轉染的細胞

2.4 Ku70敲除細胞的基因組PCR鑒定

提取細胞基因組DNA，以K-F/K-R為引物進行PCR鑒定，結果見圖4，共轉染載體pBackZero-T-Ku70和pCas-gRNA3的細胞基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后在800 bp左右出現(xiàn)目的條帶，而未轉染的對照細胞沒有此條帶，表明潮霉素B抗性基因正確插入Ku70基因的特定位點。

圖4 基因組PCR鑒定敲除Ku70基因的單克隆細胞株1，2：共轉染pBackZero-T-Ku70和pCas-gRNA3的細胞；NC：未轉染的細胞

圖5 敲除Ku70基因的單克隆細胞株Western印跡鑒定NC：野生型HeLa細胞；1～18：單克隆HeLa細胞株

2.5 分離并鑒定Ku70穩(wěn)定敲除的單克隆細胞株

用有限稀釋法篩選Ku70穩(wěn)定敲除的HeLa單克隆細胞株。將細胞接種至96孔板，培養(yǎng)1周后選取單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)，繼而收集細胞，提取細胞提取總蛋白進行Western印跡鑒定（圖5）。本次實驗共獲得18株細胞，其中14號和18號2株為敲除Ku70的單克隆細胞株。

2.6 敲除Ku70基因的穩(wěn)定細胞株生物學功能檢測

2.6.1 細胞增殖實驗 用CCK-8法檢測敲除Ku70基因的18號細胞株的增殖能力，得到18號Ku70穩(wěn)定敲除細胞（KO）和野生型HeLa細胞（WT）的生長曲線（圖6），與野生型比較，敲除Ku70基因的HeLa細胞增殖能力明顯減弱。

2.6.2 細胞遷移實驗 用Transwell方法檢測18號細胞株的遷移能力，顯微鏡下觀察并拍照（圖7A）；分別統(tǒng)計實驗組和對照組穿膜的HeLa細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學分析（圖7B）。實驗結果表明，與野生型細胞相比，敲除Ku70基因的HeLa細胞遷移能力明顯減弱。

2.6.3 實時熒光定量PCR分析敲除Ku70基因后HeLa細胞5種miRNA的表達水平 用TRIzol法提取HeLa細胞總RNA，反轉錄成cDNA，用qPCR儀檢測5種miRNA的表達水平。結果見圖8，與WT比較，敲除Ku70基因后hsa-miR-649、hsa-miR-562、hsa-miR-544a的表達水平顯著上調，hsamiR-548a、hsa-miR-492水平?jīng)]有顯著變化。

圖6 Ku70基因穩(wěn)定敲除細胞株生長曲線（n=3）WT：野生型HeLa細胞；KO：Ku70穩(wěn)定敲除細胞；*P＜0.05，***P＜0.001

3 討論

作為C-NHEJ途徑中的重要因子，Ku蛋白的DNA斷裂修復功能已經(jīng)有了較為詳盡的研究報道。與DNA斷裂修復功能類似，Ku蛋白還在保持染色體端粒結構的完整性方面發(fā)揮重要作用。在酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，Ku蛋白能夠通過結合端粒酶RNA元件TLC1的48 nt頸環(huán)結構，協(xié)助招募端粒酶，完成端粒的延伸[11-12]。但隨后又有研究表明，人Ku蛋白能夠結合端粒酶47 nt的RNA元件hTR，而hTR與TLC1并沒有相似序列[13]。Ku70還被證實能夠通過結合細胞凋亡促進因子Bax，抑制細胞凋亡。在個體水平上，Ku蛋白還被證實與衰老有關。單獨敲除Ku70或Ku80，或者二者都敲除的小鼠，均出現(xiàn)了類似的加速衰老現(xiàn)象[14]。猜測這可能與影響了C-NHEJ途徑有關，因為衰老的大鼠神經(jīng)元細胞內(nèi)和阿爾茲海默患者腦組織內(nèi)的C-NHEJ途徑均明顯減弱。缺失了Ku蛋白的作用后，C-NHEJ途徑將進一步減弱，這或許最終導致細胞和個體衰老加速[15-16]。這些研?究結果提示，Ku蛋白的生物學功能十分廣泛，還需要進一步挖掘。

圖7 Ku70基因穩(wěn)定敲除細胞株遷移能力檢測（n=3）WT：野生型HeLa細胞；KO：Ku70穩(wěn)定敲除細胞；**P＜0.01

圖8 qPCR檢測敲除Ku70后HeLa細胞5種miRNA的表達水平（n=3）WT：野生型HeLa細胞；KO：Ku70穩(wěn)定敲除細胞；**P＜0.01，***P＜0.001

Ku蛋白結合DNA的特異性早已確定，并且已經(jīng)有研究證明Ku蛋白與DNA的結合并不是依賴特定序列或堿基的[17]。生物化學分析結果顯示，Ku70亞基的3個結構域（ɑ/β結構域、DNA結合結構域、Ku80結合結構域）對于Ku蛋白聚集在雙鏈斷裂DNA末端是必需的[18]。細胞實驗表明Ku70蛋白能夠作為細胞內(nèi)的模式受體識別外來的病毒DNA，進而介導Ⅲ型干擾素的產(chǎn)生[19]。此外，Ku蛋白的RNA結合特異性也被證實。比如上面提到的Ku蛋白在維持端粒結構的過程中，就發(fā)揮了招募端粒酶RNA元件的功能。有報道稱Ku70蛋白能夠與一類具有頸環(huán)結構并且?guī)в幸粋€突出基序的RNA特異結合，這表明Ku70與RNA的結合是空間特異性的[20-21]。

為了便于深入研究Ku70蛋白的生物學功能，我們構建了Ku70基因穩(wěn)定敲除的HeLa細胞株，為后續(xù)實驗奠定了基礎。我們檢測了Ku70穩(wěn)定敲除細胞株的增殖和遷移能力等生物學功能，結果表明敲除Ku70基因后HeLa細胞增殖和遷移能力均有所減弱，提示Ku70可能參與了HeLa細胞的增殖和遷移過程。此外，我們前期的實驗結果提示Ku70蛋白可能調節(jié)miRNA表達（結果未顯示），而本研究中，我們嘗試檢測Ku70穩(wěn)定敲除細胞株中幾種可能被Ku70蛋白調節(jié)的miRNA表達水平。RT-qPCR結果顯示，3種miRNA在敲除Ku70基因的HeLa細胞中明顯上調，提示Ku70可能參與了這些miRNA的表達調控，相關的分子機制還有待進一步研究。

[1] Mimori T,Akizuki M,Yamagata H,et al.Characteriza?tion of a high molecular weight acidic nuclear protein recognized by autoantibodies in sera from patients with polymyositis-scleroderma overlap[J].Clin Invest, 1981,68(3):611-620.

[2] Mimori T,Steitz H J A.Characterization of the DNA-binding protein antigen Ku recognized by autoantibod?iesfrom patients with rheumatic disorders[J].Biol Chem, 1986,261(5):2274-2278.

[3] Vries E,Driel W,Bergsma W G,et al.HeLa nuclear protein recognizing DNA termini and translocating on DNA forming a regular DNA-multimeric protein com?plex[J].Mol Biol,1989,208(1):65-78.

[4] Griffith A J,Blier P R,Mimori T,et al.Ku polypep?tides synthesized in vitro assemble into complexes which recognize ends of double-stranded DNA[J].Biol Chem,1992,267(1):331-338.

[5] Grundy G J,Moulding H A,Caldecott K W,et al. One ring to bring them all-the role of Ku in mamma?lian non-homologous end joining[J].DNA Repair, 2014,17:30-38.

[6] Hammel M,Yu Y,Mahaney B L,et al.Ku and DNA-dependent protein kinase dynamic conformations and assembly regulate DNA binding and the initial non-homologousend joiningcomplex[J].BiolChem, 2010,285(2):1414-1423.

[7] Kragelund B B,Weterings E,Hartmann P R,et al. TheKu70/80 ringin non-homologousend-joining: easy to slip on,hard to remove[J].Front Biosci,2016, 21:514-527.

[8] Boulton S J,Jackson S P.Identification of a Saccharo?myces cerevisiae Ku 80 homologue:roles in DNA dou?ble strand break rejoining and in telomeric mainte?nance[J].Nucleic Acids Res,1996,24(23):4639-4648.

[9] Gravel S,Larrivee M,Labrecque P,et al.Yeast Ku as a regulator of chromo somal DNA end structure[J]. Science,1998,280(5364):741-744.

[10]Sawada M,Sun W,Hayes P,et al.Ku70 suppresses the apoptotic translocation of Bax to mitochondria[J]. Nat Cell Biol,2003,5(4):320-329.

[11]Stellwagen A E,Haimberger Z W,Veatch J R,et al. Ku interactswith telomeraseRNA topromotetelo?mere addition at native and broken chromosome ends [J].Genes Dev,2003,17(19):2384-2395.

[12]Fisher T S,Taggart A K,Zakian V A.Cell cycle-de?pendent regulation of yeast telomerase by Ku[J].Nat Struct Mol Biol,2004,11(12):1198-1205.

[13]Ting N,Yu Y,Pohorelic B,et al.Human Ku70/80 in?teracts directly with hTR,the RNA component of hu?man telomerase[J].Nucleic Acids Res, 2005,33(7): 2090-2098.

[14]Li H,Vogel H,Holcomb V B,et al.Deletion of Ku70,Ku80,or both causes early aging without sub?stantially increased cancer[J].Mol Cell Biol,2007,27 (23):8205-8214.

[15]Vyjayanti V N,Rao K S.DNA double strand break repair in brain:reduced NHEJ activity in aging rat neurons[J].Neurosci Lett,2006,393(1):18-22.

[16]Shackelford D A.DNA end joining activity is reduced in Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging,2006,27(4): 596-605.

[17]Walker J R,Corpina R A,Goldberg J.Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implica?tions for double-strand break repair[J].Nature,2001, 412(6847):607-614.

[18]Koike M,Yutoku Y,Koike A.Accumulation of Ku70 at DNA double-strand breaks in living epithelial cells [J].Exp Cell Res,2011,317(17):2429-2437.

[19]Zhang X,Brann T W,Zhou M,et al.Ku70 is a nov?el cytosolic DNA sensor that induces type III rather than type I IFN[J].J Immunol,2011,186(8):4541-4545.

[20]Andrey N A,Ekaterina S K,Timofey S Z,et al.Hu?man Ku70 protein bindshairpin RNA and double stranded DNA through two different sites[J].Biochimie, 2017,132:85-93.

[21]Andrew B D,Karen J G,Jennifer S P,et al.RNA recognition by the DNA end-binding Ku heterodimer [J].RNA,2013,19(6):841-851.