耿介，王超男，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，李潔，李達，白琛俊，張?zhí)?，董潔，邵寧?/p>

軍事醫(yī)學研究院 軍事認知與腦科學研究所，北京 100850

人vasorin（VASN）蛋白又稱slit-like2（SLITL2）蛋白，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，其N端胞外結構域可以被去整合素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）酶解為可溶性VASN（soluble VASN，sVASN），釋放至體液中[1]。已有文獻報道，人VASN蛋白在主動脈的血管平滑肌細胞有較高水平的表達，在腎臟、胎盤組織也有表達，并且在乳腺癌細胞、肝癌組織及細胞中也有高表達[2]。

關于VASN蛋白的生物學功能已有報道，TGF-β能夠與可溶性VASN蛋白結合，抑制TGF-β介導的上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchy?mal transition，EMT），提示VASN蛋白可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。而我們實驗室的前期工作提示VASN蛋白可能是潛在的肝癌血清標志物[4]，并且對VASN蛋白的生物學功能進行了初步探討。細胞中VASN蛋白有促進肝癌細胞增殖和遷移的作用[4]；而VASN蛋白存在于HepG2細胞來源的外泌體中，其可被轉運至人臍靜脈內皮細胞（hu?man umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中，對HUVEC的遷移也有促進作用[5]?；谝陨辖Y果，深入探討VASN蛋白的生物學功能及其分子機制，對于研究腫瘤的發(fā)生機制非常有意義。因此，我們擬構建VASN基因穩(wěn)定敲除的細胞株，為深入研究VASN蛋白的生物學功能奠定基礎。

我們利用基因編輯技術CRISPR/Cas9，將潮霉素B的抗性基因插入VASN基因，從而破壞了VASN的讀框，使VASN蛋白的表達發(fā)生異常；然后再利用潮霉素B抗性篩選獲得穩(wěn)定敲除VASN的HepG2細胞株；進而，利用穩(wěn)定敲除VASN的HepG2細胞株研究VASN的生物學功能和分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細胞由本室保存；表達載體pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro由軍事醫(yī)學研究院鄭曉飛教授惠贈；pBackZero-T載體、平末端PCR產物加A試劑盒購自TaKaRa公司；pfu酶購自北京全式金生物技術公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、T4DNA連接酶、柱式基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性核酸內切酶BamHⅠ、BsmBⅠ購自Thermo Scientific公司；PRIME jet轉染試劑購自PolyPlus公司；潮霉素B購自羅氏公司；VASN抗體由本室自行制備；引物由生工生物技術公司合成；CCK-8購自碧云天生物技術有限公司；2×SYBR PCR Mix（ROX）購自康為公司；TRIzol試劑購自Sigma公司。

1.2 構建pCas-gRNA質粒

運用Crispr Design程序（http://crispr.mit.edu/）設計針對VASN基因序列的指導 RNA（guide RNA，gRNA）的3對引物序列（表1），送生工公司合成。gRNA引物退火，用BamHⅠ和BsmBⅠ雙酶切，將酶切的退火產物與具有相同粘性末端的載體pCas-guide連接，20℃連接4 h，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，于含氨芐西林的LB培養(yǎng)板上于37℃過夜培養(yǎng)，挑取細菌單克隆PCR鑒定，分別選取2個陽性克隆測序。

1.3 構建供體DNA質粒pBackZero-T-VASN

收集HepG2細胞，按照基因組提取試劑盒說明書提取HepG2細胞基因組；以提取的細胞基因組作為PCR模板，分別以VASN-LF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR為引物，擴增VASN左、右同?源臂片段VASN-L和VASN-R；以Hy-F/Hy-R為引物，質粒pSilencer2.1-U6hygro為模板，擴增潮霉素B抗性基因片段Hy；將片段VASN-L、Hy和VASNR混合作為模板，以VASN-LF和VASN-RR為引物進行重疊PCR，擴增目的片段VASN-KO；用平末端PCR產物加A將單個堿基A加在VASN-KO片段末端，進而與pBackZero-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取細菌單克隆PCR鑒定，選取4個陽性克隆測序。

表1 合成的引物序列

1.4 細胞轉染及VASN穩(wěn)定敲除細胞株篩選

將HepG2細胞以1×105/mL接種于6孔細胞板中，當細胞生長至約40%時轉染1 μg pCasgRNA質粒，48 h后再轉染1.5 μg pBackZero-TVASN質粒；約5 d后，將轉染后的HepG2細胞以6×104/mL的密度接種到100 mm2細胞培養(yǎng)皿中，待細胞完全貼壁后加入潮霉素B（300 μg/mL）進行抗性篩選，2～3 d換液一次；培養(yǎng)至第10 d在顯微鏡下觀察細胞培養(yǎng)皿，可以看到已有單克隆形成，將其轉移至6孔板中繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

無限稀釋法篩選VASN穩(wěn)定敲除的HepG2單克隆細胞株。胰酶消化細胞，以新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度為10/mL，將稀釋的細胞懸液接種至96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)1周后顯微鏡下觀察，選取單克隆細胞擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)至24孔板時，培養(yǎng)基中加入300 μg/mL潮霉素B繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 Western印跡檢測VASN敲除細胞株中的VASN蛋白含量

用含潮霉素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，每泳道40 μg蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡鑒定，一抗為本室自制的鼠源VASN抗體（終濃度1 μg/mL），4℃孵育整夜，二抗為HRP標記的羊抗小鼠IgG,室溫孵育約1 h，ECL顯影。

1.6 RT-PCR檢測VASN敲除細胞株中VASN mRNA水平

用含潮霉素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，收集細胞，TRIzol提取細胞總RNA，取1 μg RNA，以Oligo dT為引物，用反轉錄酶將RNA反轉成cDNA。20 μL體系中，以1 μL cDNA為模板，VASN-F/ VASN-R為引物進行RT-PCR實驗，檢測VASNmRNA表達水平。

1.7 細胞增殖實驗

細胞生長曲線可以直觀地反映細胞的增殖能力。胰酶消化對數(shù)生長期的VASN穩(wěn)定敲除的細胞和野生型HepG2細胞，用新鮮培養(yǎng)基將細胞稀釋至104/mL，按100 μL/孔種于96孔板。細胞貼壁時記為零點，分別在0、24、48、72、96 h時加入10 μL CCK-8試劑，細胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，測定不同時間點的D450nm值，繪制細胞生長曲線。

1.8 Tranwell細胞遷移實驗

將VASN穩(wěn)定敲除的HepG2細胞和野生型HepG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，收集細胞，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞至2×105/mL；取200 μL細胞懸液種于Transwell小室的上層，小室下層加入500 μL新鮮培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；用棉簽擦去Transwell小室上層內側細胞，用0.1%結晶紫染色，室溫放置30 min；將多余的結晶紫沖洗干凈，顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照；用30%的醋酸酒精洗脫穿膜的細胞，測定D450nm值。

1.9 統(tǒng)計學方法

用SAS軟件分析數(shù)據(jù)，采用Student'st檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 構建pCas-gRNA質粒

用Crispr Design程序設計gRNA，將靶位點序列設定在VASN編碼基因起始位點后200～400 bp。為了降低脫靶的可能，共選取了3條gRNA序列。將合成的3對DNA片段分別退火形成雙鏈，進而雙酶切，然后與具有相同粘性末端的pCAS-guide載體連接，獲得重組質粒pCAS-gRNA。重組子分別轉化感受態(tài)細胞，LB平板培養(yǎng)，氨芐西林抗性篩選，挑取單克隆進行菌落PCR，鑒定為陽性的克隆測序（圖1），結果表明3個pCAS-gRNA質粒均構建成功。

2.2 構建供體DNA質粒pBackZero-T-VASN

以HepG2細胞基因組為模板，分別以VASNLF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR為引物，擴增VASN左、右同源臂片段VASN-L和VASN-R；以Hy-F/Hy-R為引物，質粒pSilencer2.1-U6hygro為模板，擴增潮霉素B抗性基因片段Hy（約1100 bp）（圖2A）。將片段VASN-L、Hy和VASN-R混合作為模板，以VASN-LF和VASN-RR為引物擴增VASN同源臂供體DNA片段VASN-KO（圖2B）。將單個堿基A添加在VASN-KO片段末端，進而與pBackZero-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，菌落PCR鑒定為陽性的克隆測序（圖3）。序列比對結果顯示，同源臂供體質粒pBackZero-T-VASN構建成功。

圖3 菌液PCR鑒定陽性克隆M：DNA marker DL2000；1～8：單克?。籒C：陰性對照；PC：陽性對照

2.3 基因組水平鑒定轉染細胞株

將pCas-gRNA與pBackZero-T-VASN共轉染HepG2細胞，基因組發(fā)生同源重組，潮霉素B抗性基因插入VASN基因的特定位點，使VASN不能正確表達。提取轉染的細胞基因組DNA，以KO-F/ KO-R為引物進行PCR鑒定。結果顯示2個重組質粒轉染的細胞基因組DNA經PCR擴增后在750 bp處出現(xiàn)目的條帶，而野生型HepG2細胞則無條帶，證明潮霉素B抗性基因正確插入VASN基因的特定位點（圖4），VASN讀框已被破壞，VASN蛋白不能表達。

圖4 基因組PCR鑒定M：DNA marker DL5000；NC：陰性對照；1、3、4：插入潮霉素B基因后片段

2.4 Western印跡鑒定VASN穩(wěn)定敲除的單克隆細胞株

用無限稀釋法篩選VASN敲除的細胞單克隆，培養(yǎng)約1周后顯微鏡下觀察，將含有單克隆細胞的孔繼續(xù)培養(yǎng)，并加入潮霉素進行抗性篩選。當細胞數(shù)量足夠時，取出部分細胞提取總蛋白，Western免疫印跡鑒定，結果顯示1～5號克隆的VASN蛋白表達水平均明顯下調，1、4號最為顯著（圖5）。

2.5 RT-PCR鑒定VASN穩(wěn)定敲除的單克隆細胞株

經過Western印跡鑒定，1號（1#）和4號（4#）VASN穩(wěn)定敲除細胞中的VASN蛋白含量最低，因此將篩選出的1#、4#細胞做基因水平鑒定。收集細胞提取總RNA，反轉錄為cDNA，qPCR鑒定其VASNmRNA表達。1#細胞的VASNmRNA表達水平最低，只有野生型HepG2細胞（WT）的1/7（圖6），統(tǒng)計學分析表明二者有明顯差異，說明1#單克隆細胞中的VASN基因被基本敲除。

圖5 Western印跡檢測單克隆細胞株中VASN的表達

圖6 RT-PCR鑒定VASN的mRAN水平WT為野生型HepG2細胞，1#、4#為VASN穩(wěn)定敲除細胞

2.6 VASN穩(wěn)定敲除的細胞株增殖能力下降

為了驗證VASN蛋白對細胞增殖能力的影響，利用CCK-8法檢測VASN敲除細胞和野生型細胞的增殖情況。將篩選出的1#VASN敲除細胞和野生型細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以1000/孔的濃度種于96孔板，貼壁后分別于0、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8，37℃孵育1.5 h后測定D450nm值，得到細胞生長曲線（圖7）。可以看出野生型HepG2細胞的生長速度明顯高于VASN敲除細胞株，并且兩者的差距隨著時間的延長逐漸增大（P＜0.05）。此結果提示VASN蛋白可能參與細胞增殖過程。

圖7 細胞生長曲線WT為野生型HepG2細胞，1#為VASN穩(wěn)定敲除細胞

2.7 VASN穩(wěn)定敲除的細胞株遷移能力下降

細胞遷移是反應細胞運動能力的重要指標，而且與侵襲和轉移能力密切相關。我們利用Transwell實驗檢測了1#VASN敲除細胞和野生型HepG2細胞的遷移能力。結果顯示，VASN敲除的細胞在膜上的覆蓋面積明顯小于野生型HepG2細胞（圖8）。將穿過小室的細胞用30%醋酸洗脫，酶聯(lián)儀測定D450nm值（圖9），野生型HepG2細胞穿膜的細胞數(shù)約為VASN敲除細胞的2倍，VASN敲除細胞的遷移能力明顯減弱（P＜0.05）。此結果提示VASN可能參與細胞的遷移過程。

圖8 結晶紫染色觀察細胞遷移（400×）A：野生型HepG2細胞；B：1#VASN穩(wěn)定敲除細胞

圖9 穿過Transwell小室的細胞吸光度A：野生型HepG2細胞；B：1#VASN穩(wěn)定敲除細胞

3 討論

自2004年Yuichi Ikeda等首次鑒定出VASN蛋白，迄今相關研究較少。已有報道顯示，VASN蛋白可能與機體發(fā)育、血管損傷修復及腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。我們的前期工作表明，VASN不僅可能是一種新型的肝癌血清標志物，而且可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。

CRISPR/Cas9是新興的基因編輯技術[6]，具有構建簡單、剪切高效的特點[7]。向導RNA通過堿基互補配對，精確靶向目的基因序列，募集Cas9核酸內切酶到達目的基因，剪切基因組DNA。細胞通過2種修復機制，即同源重組修復和非同源末端連接修復，修復斷裂的雙鏈DNA[8-9]，本研究采用了精確度相對高的同源重組修復策略[10]，并且在提供同源重組所需的同源臂的同時，將潮霉素B抗性基因及終止子插入VASN基因起始位點下游，破壞VASN基因的開放讀框，VASN蛋白不能正常表達，而抗性基因的表達為后續(xù)細胞篩選提供了便利。

在建立VASN穩(wěn)定敲除HepG2細胞株后，我們開展了VASN蛋白生物學功能的初步探索和驗證。利用CCK-8法和Transwell實驗分別對比分析了VASN穩(wěn)定敲除細胞株和野生型HepG2細胞間在增殖和遷移能力上的差異，結果顯示缺失VASN蛋白可導致細胞增殖、遷移能力減弱，與已有研究結果相符，也進一步證明VASN缺失細胞株構建成功。這為深入闡釋VASN的生物學功能及其分子機制奠定了基礎。

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