自加吉，孫美濤，王唯斯，陳瑩，戴莉萍，余敏，熊偉

1.大理大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南 大理 671000；2.大理州第一人民醫(yī)院 病理科，云南 大理671000；3.云南大學 生命科學學院，云南 昆明 650091

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，病死率居婦科惡性腫瘤的首位，且發(fā)病率逐年增加[1]。雖然近年發(fā)現(xiàn)了很多新的治療方式，但其預后仍未得到明顯改善[2]。目前，診斷卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子標記物仍然十分有限。人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1（mitochondrial transcription termi?nationfactor1，MTERF1）基因定位于染色體7q21.2，包含4個外顯子，其編碼的蛋白由399個氨基酸殘基構(gòu)成，具有3個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和2個獨立的DNA結(jié)合區(qū)[3]。MTERF1蛋白與線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）上編 碼 16S rRNA基因與tRNALeu（UUR）基因分界處的一段28 bp的序列特異結(jié)合，從而終止mtDNA重鏈的轉(zhuǎn)錄[4]。對人宮頸癌HeLa細胞株的體外研究發(fā)現(xiàn)，MTERF1蛋白正調(diào)控腫瘤細胞的線粒體基因表達和氧化磷酸化水平，進而促進腫瘤細胞的增殖，提示MTERF1在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[5]。然而，MTERF1基因在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍不清楚。以基因芯片或轉(zhuǎn)錄組分析為代表的高通量測序目前已成為癌癥研究的強大工具，但由于樣本數(shù)量、測序平臺及分析方法的不同，常導致實驗結(jié)果有偏差，分析結(jié)果比較片面。如何有效利用上述資源，是當前科研人員面臨的重要問題。數(shù)據(jù)整合分析可聯(lián)合多種數(shù)據(jù)消除以上因素的影響，從整體角度來理解這些數(shù)據(jù)，因而生物數(shù)據(jù)整合分析逐漸成為大數(shù)據(jù)挖掘的重要方向，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種類型的癌癥分析中[6]。Oncomine數(shù)據(jù)庫是大型腫瘤基因芯片整合數(shù)據(jù)庫，最新數(shù)據(jù)涵蓋已知所有的癌癥類型，包含715個數(shù)據(jù)集，共計86 733個癌組織及正常組織數(shù)據(jù)。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫可以進行腫瘤及其相應(yīng)的正常組織中的表達差異分析，尋找潛在感興趣的基因，其整合的大量數(shù)據(jù)保證分析結(jié)果具有極大的參考價值，也可以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標記物和基因治療靶點。

1 材料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中挖掘數(shù)據(jù)

本實驗中，我們在Oncomine數(shù)據(jù)庫設(shè)定的篩選條件為：①Gene：MTERF1；②Analysis type：can?cervs.normalanalysis；③Cancertype：ovarian cancer；④Data type：mRNA；⑤Sample type：clini?cal specimen；⑥臨界值設(shè)定條件：P＜0.0001，fold change＞2.0，gene rank=top 10%。

1.2 Real time RT-PCR檢測MTERF1 mRNA在卵巢癌和正常卵巢上皮組織中的表達

選取2016年大理州第一人民醫(yī)院病理科收集的10例卵巢癌組織及其對應(yīng)的正常卵巢上皮組織，提取各組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，調(diào)整各組間cDNA濃度一致，用CFX96熒光定量PCR擴增儀分別擴增目的基因和內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72延伸10 min。每個樣品設(shè)置3個復孔，所有實驗重復3次。根據(jù)內(nèi)參的標準化計算目的基因的相對表達量，即

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列

計算卵巢癌組織中MTERF1mRNA水平與其對應(yīng)正常卵巢上皮組織的mRNA水平的比值。

1.3 Western印跡檢測MTERF1蛋白在卵巢癌和正常卵巢上皮組織中的表達

提取10例卵巢癌及其配對正常卵巢上皮組織總蛋白，采用BCA法測定各組蛋白質(zhì)的濃度。取40 μg蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE分離總蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1000稀釋的兔抗人MTERF1單克隆抗體，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，內(nèi)參為GAPDH；TBST液洗滌3次，每次5 min，加入1∶2000稀釋的羊抗兔二抗，4℃孵育2 h；TBST洗滌3次，每次5 min。將超敏型ECL顯影液滴于PVDF膜條上，用ImageQuant LAS500超靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯色曝光，掃描成圖像。采用Image J 1.46軟件對蛋白質(zhì)條帶進行灰度值分析，計算MTERF1/GAP?DH灰度值比值。

1.4 Kaplan-Meier plotter分析患者生存周期

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫含有從基因表達匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中下載的包括mRNA表達和臨床資料的1657例卵巢癌病例信息。利用在線數(shù)據(jù)庫（http://kmplot. com/analysis/）的卵巢癌數(shù)據(jù)集對MTERF1進行分析，得到相應(yīng)的Kaplan-Meier生存曲線、風險比（hazard ratio，HR）及Log rankP（Pvalue）值。

1.4.1MTERF1表達水平與卵巢癌患者預后的關(guān)系 探針選擇為JetSet best probe set，所需有效Affymetrix ID為204871_at（MTERF1）。首先根據(jù)MTERF1mRNA水平分為低表達組和高表達組，截尾數(shù)據(jù)為癌癥無進展生存期（progression-freesurvival，PFS），符合條件的總病例數(shù)為1436例，分析MTERF1表達水平與卵巢癌預后的關(guān)系；然后截尾數(shù)據(jù)為總生存期（overall survival，OS），符合條件總病例數(shù)為1657例，分析MTERF1表達水平與卵巢癌預后的關(guān)系。篩選條件為：①Cancer：Ovarian cancer；②Gene：MTERF1；③Survival：PFS or OS。

1.4.2MTERF1表達對不同分期卵巢癌患者預后的影響 探針選擇為JetSet best probe set，然后分別設(shè)截尾數(shù)據(jù)為OS和PFS，所需有效Affyme?trix ID為204871_at（MTERF1），在Stage選項下分別選擇1期、1+2期、2期、2+3期、2+3+4期、3期、3+4期、4期，在線分析MTERF1表達對不同分期卵巢癌患者預后的影響。

1.5 統(tǒng)計學分析

正常卵巢組織和卵巢癌病例組之間MTERF1表達的差異采用t檢驗。所有統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析MTERF1在卵巢癌中的表達

自2001年始，Oncomine數(shù)據(jù)庫中共有8個研究涉及MTERF1在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達，包括2211個樣本[7-12]。薈萃8個研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，人MTERF1在卵巢癌中高表達，其中位數(shù)為3867.0，其高表達具有顯著性差異（P=0.042）。Oncomine數(shù)據(jù)庫中有4個基因芯片數(shù)據(jù)集研究的統(tǒng)計分析結(jié)果，顯示卵巢癌中MTERF1mRNA高表達（圖1）。

2.2 卵巢癌組織與正常卵巢上皮組織中MTERF1 mRNA的表達

Real time RT-PCR檢測10例卵巢癌及其配對正常卵巢上皮組織中MTERF1mRNA表達水平，結(jié)果顯示6例卵巢癌組織的MTERF1mRNA水平較正常卵巢上皮組織顯著增高（P＜0.05），4例卵巢癌組織中增高不顯著（P＞0.05）（圖2）。

2.3 卵巢癌組織與正常卵巢上皮組織MTERF1蛋白的表達

Western印跡檢測10例配對卵巢癌與正常卵巢上皮組織中MTERF1蛋白的表達水平，結(jié)果同樣顯示6例卵巢癌組織中MTERF1蛋白水平較正常卵巢上皮組織顯著增高（P＜0.05），4例卵巢癌組織中增高不顯著（P＞0.05），與mRNA表達水平的檢測結(jié)果一致（圖3）。

2.4 卵巢癌患者的預后與MTERF1 mRNA表達量的關(guān)系

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫部分所選隊列中MTERF1基因在卵巢癌中的表達研究結(jié)果A：Yoshihara等（P＜0.001）；B：TCGA（P=0.004）；C：Adib等（P=0.256）；D：Lu等（P=0.026）

采用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進行生存周期分析、風險比和Log-Rank檢驗，進一步明確MTERF1基因表達量與卵巢癌病人預后的關(guān)系。當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者PFS，數(shù)據(jù)庫中符合條件的病例總數(shù)為1436例，且涵蓋各個分期的卵巢癌病例。經(jīng)Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，HR=1.22，log-rankP值為0.002。當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者OS，數(shù)據(jù)庫中符合條件的病例總數(shù)為1657例，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，HR=1.12，Log rankP值為0.091（圖4）。

2.5 各分期卵巢癌患者預后與MTERF1 mRNA水平的關(guān)系

圖2 10例卵巢癌與其相應(yīng)的正常卵巢上皮組織中MTERF1 mRNA表達水平的比值（*P＜0.05）

截尾數(shù)據(jù)為PFS時，早期卵巢癌（1、1+2或2期）中MTERF1表達水平越高，患者無進展生存期越短，預后越差（HR＞1）（表2）。其中，1+2期卵巢癌中HR值為2.23，表明越早期的卵巢癌患者，MTERF1的預后價值越大。將截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS，MTERF1的表達水平與卵巢癌患者的預后無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。因此，早期（1+2期）卵巢癌患者中MTERF1mRNA水平越高，無進展生存期越短，預后越差（P＜0.05）。

3 討論

圖3 10例卵巢癌與其相應(yīng)的正常卵巢上皮組織中MTERF1蛋白表達水平的比值（*P＜0.05）

卵巢癌在女性常見惡性腫瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系統(tǒng)癌瘤中占第3位，次于宮頸癌和宮體癌。但在女性生殖系統(tǒng)癌瘤中，卵巢癌的病死率最高[13]，75%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，并且具有比較明顯的個體差異性[14]。目前，臨床用于卵巢癌診斷的腫瘤標記物十分有限。發(fā)現(xiàn)能用于診斷和預后的卵巢癌分子標記物具有現(xiàn)實意義。

圖4 MTERF1 mRNA表達量與卵巢癌患者預后的關(guān)系A(chǔ)：截尾數(shù)據(jù)為PFS；B：截尾數(shù)據(jù)為OS

MTERF1基因是MTERF超基因家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員。研究表明，與MTERF1蛋白結(jié)合的線粒體tRNALeu（UUR）基因A3243G位點的堿基突變，將引起線粒體糖尿病、線粒體腦肌病伴高?乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征、進行性眼外肌麻痹等疾病。mtDNA靶序列A3243G點突變引起人MTERF1與DNA的親合力下降，但并不改變線粒體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的的比例，但線粒體蛋白質(zhì)合成能力和細胞的呼吸活性下降將導致線粒體疾病[15]。目前，關(guān)于MTERF1基因在卵巢癌中的表達及其意義尚未見相關(guān)報道。Oncomine是一個大型腫瘤基因芯片分析整合數(shù)據(jù)庫，提供公開、免費的整合分析資源，數(shù)據(jù)來源為公開發(fā)表的各種高通量測序數(shù)據(jù)。Oncomine平臺為不熟悉高通量分析的科研工作者提供了獲取整合信息的便捷途徑，輸入基因名稱即可得到該基因在各種類型腫瘤中的表達差異等分析結(jié)果，并且以直觀的形式輸出[16]。通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫的整合分析，我們發(fā)現(xiàn)MTERF1在卵巢癌中顯著高表達。我們分別采用熒光定量PCR和Western印跡對10例卵巢癌組織及其配對的正常卵巢上皮組織中MTERF1mRNA和蛋白質(zhì)表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)6例卵巢癌組織中MTERF1高表達，其結(jié)果得到進一步證實。本研究的不足之處為樣本數(shù)量有限，亟待擴大樣本量進一步研究。

Kaplan-Meier plotter是目前被廣泛接受的一個預后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫，涵蓋了10 461例腫瘤樣本，其中包括1816例卵巢癌樣本、5143例乳腺癌樣本、1065例胃癌樣本和2437例肺癌樣本，可以對54 675個基因進行相關(guān)預后分析，并得出真實可信的客觀結(jié)果[17-18]。本研究首次通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫探討MTERF1在卵巢癌及不同分期卵巢癌中的預后價值。結(jié)果顯示，卵巢癌分期未明時，MTERF1表達水平越高，患者的無進展生存期越短，預后越差。但MTERF1表達水平與卵巢癌患者的總生存期無相關(guān)性。在1+2期卵巢癌，當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為PFS時，HR值為2.23，Log rankP＜0.01；而當截尾數(shù)據(jù)為OS時，HR值為1.53，Log rankP=0.59?？紤]到OS為總生存率，患者死亡原因可能存在非腫瘤致死，推測MTERF1可以較好地用于1+2期卵巢癌患者預后；而在晚期（3期及以后）卵巢癌患者中，無論是PFS還是OS，都與MTERF1的表達水平?jīng)]有顯著相關(guān)性，因此推測MTERF1對晚期卵巢癌不具備預后價值。

表2 各個分期卵巢癌患者的預后與MTERF1 mRNA水平的關(guān)系

綜上所述，我們通過Oncomine和Kaplan-Mei?er plotter數(shù)據(jù)庫對腫瘤相關(guān)基因的信息進行深入挖掘，提出MTERF1在卵巢癌組織中高表達；通過real time RT-PCR和Western印跡對卵巢癌及其配對的正常卵巢上皮組織中MTERF1mRNA和蛋白水平進行檢測，證實MTERF1在卵巢癌組織中高表達；進而分析MTERF1表達對卵巢癌患者預后的影響，發(fā)現(xiàn)MTERF1與早期卵巢癌的預后有關(guān)，為進一步探討MTERF1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

[1] Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancer statistics, 2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[2] 李莉,熊國平,顏琳,等.CCNB1在卵巢癌中的表達及意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2016,25(11):818-820.

[3] 熊偉,楊勇琴,張海洋,等.人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1 (hMTERF1)蛋白的生物信息學分析[J].生物信息學, 2015,13(1):23-30.

[4] 熊偉,余敏,左紹遠.線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族在線粒體基因表達中的調(diào)節(jié)作用[J].中國生物化學與分子生物學報,2015,31(3):223-231.

[5] Chen G,Dai J,Tan S,et al.MTERF1 regulates the oxidative phosphrylation activity and cell proliferation in C-33A cells[J].Acta Biochim Biophys Sin,2014, 46(6):512-521.

[6] 王巍,張志常,宋曉雯,等.基于數(shù)據(jù)挖掘分析PDCD5表達對胃癌預后的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2016,24(24): 3957-3959.

[7] Adib T R,Henderson S,Perrett C,et al.Predicting biomarkers for ovarian cancer using gene-expression microarrays[J].Br J Cancer,2004,90(3):686-692.

[8] Bonome T,Levine D A,Randonovich M,et al.A gene signature predicting for survival in subopimally debulked patients with ovarian cancer[J].Cancer Res, 2008,68(13):5478-5486.

[9] HendrixN D,Wu R,Kuick R,etal.Fibroblast growth factor 9 has oncogenic activity and is a down?stream target of Wnt signaling in ovarian endometri?oid adenocarcinomas[J].Cancer Res,2006,66(3):1354-1362.

[10]Lu K H,Patterson A P,Wang L,et al.Selection of potentialmarkersforepithelialovarian cancerwith gene expression arrays and recursive descent partition analysis[J].Clin Cancer Res,2004,10(10):3291-3300.

[11]Welsh J B,Zarrinkar P P,Sapinoso L M,et al.Anal?ysis of gene expression profiles in normal and neoplas?tic ovarian tissue samples identifies candidate molecu?lar markers of epithelial ovarian cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(3):1176-1181.

[12]Yoshihara K,Tajima A,Komata D,et al.Gene expres?sion profiling of advanced-stage serous ovarian can?cers distinguishes novel subclasses and implicates ZEB2 in tumor pregression and prognosis[J].Cancer Sci,2009,100(8):1421-1428.

[13]宮艷秋,韓鳳娟,吳效科,等.卵巢上皮性癌病因?qū)W研究進展[J].醫(yī)學研究雜志,2010,39(5):18-20.

[14]朱秀嫻,章曉樂,傅永倫,等.孕激素抑制LH峰在控制性卵巢刺激過程中的療效觀察[J].生殖與避孕,2015, 35(6):384-388.

[15]陽婭玲,肖紅利,管敏鑫.人類線粒體tRNA生物合成與線粒體疾病[J].中國生物化學與分子生物學報, 2013,29(10):916-925.

[16]王進峰,盧曉明,王禮平,等.基于Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫薈萃分析碳酸苷酶IX在腎細胞癌中的表達及意義[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2015,7(4):231-235.

[17]Szasz A M,Lanczky A,Nagy A,et al.Cross-valida?tion of survival associated biomarkers in gastric can?cer using transcriptomic data of 1065 patients[J].Onco?target,2016,7(31):49322-49333.

[18]Ocana A,Perez-Pena J,Alcaraz-Sanabria A,et al.In silico analyses identify gene-sets,associated with clini?cal outcome in ovarian cancer:role of mitotic kinases [J].Oncotarget,2016,7(16):22865-22872.