韓佳煒 王淑華 李桂平 鄭健剛

1)天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193 2)中國人民解放軍第254醫(yī)院，天津 300142 3)天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，是腦血管病中發(fā)病急驟、病情嚴(yán)重、致殘率高、病死率高的疾病[1]。其發(fā)病率在我國約占全部腦卒中的20%～30%，急性期的致死率為30%～40%[2]。該病好發(fā)于40～70歲人群，且近年來發(fā)病人群有趨于年輕化[3]。因此，探索腦出血發(fā)病原因、病理生理變化、腦損傷機制對于更好的預(yù)防和治療腦出血至關(guān)重要。建立能切實模擬人類腦出血機制和病理生理變化、穩(wěn)定性高、可重復(fù)性好的動物模型，是開展動物實驗研究的必要前提。其中大鼠因價格低廉、容易獲取、易于管理且大鼠腦尾殼核是腦內(nèi)最大的核[4]，易于實驗中立體定位，而尾殼核又屬于基底節(jié)，基底節(jié)又為人類腦出血的好發(fā)部位，所以在實驗中用大鼠腦尾殼核出血模擬人腦出血已被廣泛應(yīng)用[5]。目前，已經(jīng)積累了大量成熟的生理、病理、藥理、形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)方面的相關(guān)實驗基礎(chǔ)資料?，F(xiàn)就大鼠應(yīng)用于腦出血實驗研究的現(xiàn)狀作以綜述，并且分享200例大鼠二次自體注血法腦出血手術(shù)過程中操作感悟以及操作技巧，以供研究人員選擇最合適的造模方法開展實驗研究，提高動物實驗的相似度和可信度。

1 造模方法

根據(jù)目前大鼠腦出血動物模型實驗相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)，造模方法總體可以分為四類[6-9]：自體血注入法、膠原酶誘導(dǎo)法、微球囊充脹法、自發(fā)性腦出血。

1.1自體血注入法該方法是注射動物非肝素化自體血，形成的腦出血模型十分接近人類腦出血，適合用于研究腦出血的自然發(fā)生發(fā)展過程和病理生理形態(tài)學(xué)的特點，能模擬血腫占位數(shù)效應(yīng)以及腦出血過程中血液成分中各種因子對腦組織代謝和血流量的影響，并可探索腦出血后繼發(fā)的腦損害與腦水腫的形成機制，血凝塊釋放的毒性作用，損傷腦組織局部的炎性反應(yīng)以及出血后細(xì)胞凋亡機制，是目前應(yīng)用最廣泛的一種造模方法。但該方法也存在一定缺點，血腫的形態(tài)和大小無法確定，導(dǎo)致模型間存在的一定的差異，而且血腫壓力不確定容易脹裂腦組織流入腦室。注血速度稍快血液就會沿針道反流，這一缺點目前通過減慢注射速率延長留針時間，增加注血次數(shù)已得到有效改善。

1.1.1 取血方法：實驗中多采用的取血方法有：大鼠內(nèi)眥取血、斷尾取血、尾動脈穿刺抽取、股動脈穿刺抽取、心臟穿刺等方法。然而，目前尚無各取血方法之間的詳盡對比，現(xiàn)將其各適用范圍比較總結(jié)如下。

1.1.1.1 內(nèi)眥取血：其優(yōu)點是簡單易行、血液標(biāo)本不易被污染、一次采血量2～3 mL，且對大鼠的創(chuàng)傷小。但其缺點相對明顯，內(nèi)眥取血多為眶后靜脈叢的靜脈血，與腦出血多為動脈破損造成出血不相吻合，因動靜脈血含氧量不同等差異，導(dǎo)致靜脈血不能完全模擬動脈血管破損造成腦出血的生理過程[10]。

1.1.1.2 斷尾取血：其優(yōu)點為操作簡單易行、對大鼠創(chuàng)傷小、不會影響大鼠肢體功能活動，成功率高，基本無死亡。其缺點為血液標(biāo)本易被污染，易混雜鼠尾部的毛和皮屑，且鼠尾取血為動靜脈的混合血伴有組織液，注入腦組織后不能完全模擬人類腦出血動脈血管破損造成的生理過程，因此不建議采用于腦出血動物模型的實驗研究。

1.1.1.3 尾動脈穿刺取血：優(yōu)點為血液為相對純凈的動脈血，手術(shù)不影響大鼠肢體功能，且操作相對簡單，成活率也相對較高，故該種取血方法為腦出血動物實驗中比較推薦的。本次實驗采用的亦是尾動脈穿刺取血。

1.1.1.4 股動脈穿刺取血：優(yōu)點為血液為相對純凈的動脈血，但該方法缺點相對較多，手術(shù)取血操作相對麻煩，要求實驗者技術(shù)熟練，術(shù)后會影響大鼠的肢體活動，影響對于腦出血大鼠造模是否成功的行為學(xué)評分，且該方法成功率較低[11]，故實驗中應(yīng)用的相對較少。

1.1.1.5 心臟穿刺取血：其優(yōu)點為心室腔穿刺取血時間短、不易凝血、簡便易行、損傷小等優(yōu)點。缺點為：對于實驗操作人員的要求相對較高，必須有熟練的操作技能，穿刺位點必須準(zhǔn)確，避免反復(fù)穿刺以致大鼠死亡[12]。

1.1.2 注血方法

1.1.2.1 二次注血法：1996年DEINSBERGER提出二次注血法制作大鼠腦出血動物模型[13]。在1982年ROPPER[14]首次應(yīng)用自體血注入建立腦出血動物模型基礎(chǔ)上，將自體血分兩次注入腦組織，這種辦法延長注射時間、減慢注射速率，有效的減少了血液沿針道反流的現(xiàn)象，同時也避免了血液進(jìn)入腦室和蛛網(wǎng)膜下腔[15]。

1.1.2.2 三次注血法[16]：與二次注血法相比，可用于出血量更大的模型的一種注射方法，這種注射方法既能有效的防止血液沿針道反流至硬膜下腔，同時又可以避免注入速率過快導(dǎo)致腦內(nèi)局部壓力迅速升高從而血腫沖破腦室。所形成的血腫形態(tài)大小部位更為穩(wěn)定[17]，成功率約為75%[18]。

1.2膠原酶誘導(dǎo)腦內(nèi)注射膠原酶誘導(dǎo)腦組織出血。膠原酶是一組能特異降解血管內(nèi)皮細(xì)胞間基質(zhì)下基底膜膠原成分的基質(zhì)金屬蛋白酶，主要分布于人體腦血管內(nèi)，存在于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，病理情況下，可以被釋放激活。膠原酶有很多種，其中Ⅶ型膠原酶在制備腦出血動物模型中應(yīng)用最為廣泛[19]。這種方法制備的腦出血模型有其特有的優(yōu)點：模型的成功率和穩(wěn)定性較高，造模方法相對簡便[20]，能比較好的模擬人類自發(fā)性顱腦出血[21]以及出血后血腫持續(xù)擴大的情況[20，22]。但缺點是膠原酶會有較明顯的炎癥反應(yīng)[21]，對血管也會產(chǎn)生破壞作用[23]，故不適用于腦出血后炎癥反應(yīng)機制的研究。且其形成的并非真正意義上的血腫，而是彌漫性滲血，故出血量大小難以控制[24]，重復(fù)性相對較差。與注自體血法造腦出血模型相比，該方法造模因凝血酶對腦組織有直接細(xì)胞毒性作用[25]，對血腦屏障的損害程度更為嚴(yán)重，神經(jīng)功能缺損程度也更重[26]，恢復(fù)時間較長[27]。故更適用于評估腦出血后各類指標(biāo)的長期的觀察。

1.3微球囊充脹法SINAR等[9]向腦內(nèi)插入微球囊，充脹球囊以模擬腦出血血腫壓迫腦組織使顱內(nèi)壓升高的狀況，這是一種機械的腦出血模型制作方法。該方法的優(yōu)點是能人為控制血腫機械壓迫的范圍，可復(fù)制性強，同時也避免了自體血注入法導(dǎo)致的血液破入腦室或血腫形態(tài)不一，但也存在其明顯的缺點，不同于真正意義上的腦出血，沒有血液成分的參與，不能用來評價腦出血后血凝塊的毒性作用、引起的一系列細(xì)胞毒性反應(yīng)以及血液本身的成分如凝血酶、血紅蛋白、腦紅蛋白等因素造成的損害，故近年對于腦出血的研究已經(jīng)較少采用。但可用微球囊充氣和放氣的過程模擬血腫形成和清除的過程，可用于探索外科血腫清除術(shù)的最佳開展時機[28]。

1.4自發(fā)性腦出血目前主要有兩種：一種是通過改變遺傳基因而獲得的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive cerebral hemorrhage in rat，SHCHR)[29]。該種鼠卒中率高，能重現(xiàn)人類自發(fā)性腦出血發(fā)病的全過程[30]，但出血部位和出血量難以控制，而且該種鼠難于獲得，易變種、斷種，飼養(yǎng)困難，價格昂貴，所以限制了其在實驗中的普及應(yīng)用。另一種是腎原性高血壓大鼠[8、31]，用銀夾鉗夾住大鼠雙側(cè)腎動脈，制作出該模型。該模型優(yōu)點是造模簡單，易于飼養(yǎng)。但與自發(fā)性高血壓大鼠相比，兩者都存在出血部位及出血量無法控制的缺點，且該種方式制作的大鼠模型自發(fā)性腦出血的發(fā)生率比較低，更不利于實驗中廣泛應(yīng)用。

1.5本研究大鼠腦出血動物模型的建立此次研究，我們采取自體血注入造模，在尾動脈穿刺取血，行二次注血法，具體操作如下：在室溫條件下，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mL/kg)，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，使門齒溝平面比耳尖線平面低2.4 mm，此時前囟和后囟基本保持在同一平面上。固定時先固定耳尖線，聽到水平針穿破骨膜的聲音后，再移位至正中，接著固定門齒于門齒溝上。常規(guī)備皮消毒頭皮正中，在消毒部位正中剪一小口，分離皮下組織，用30%雙氧水腐蝕顱骨腱膜及顱骨外膜，暴露前囟及冠狀縫，在前囟前0.6 mm中線旁3 mm處，用電鉆鉆直徑1 mm的圓孔，深度達(dá)硬腦膜表面，不損及腦組織。用微量注射器取不抗凝自體尾動脈血55 μL，然后將微量注射器固定于立體定位儀的上方，將針尖沿鉆孔膜垂直進(jìn)針，深度約6 mm，以10 μL/min速度緩慢注射20 μL血液后靜置5 min(如圖1)，再以同樣的速度注射剩余的35 μL，注射完成后，針尖靜置10 min后緩慢退針。留針期間用酒精棉球包扎鼠尾端傷口。退針后，用醫(yī)用無菌骨蠟封閉骨孔，無出血后縫合頭部皮膚，創(chuàng)傷處用碘酚消毒，并噴以青霉素以防感染。

圖1 自體血注入法腦出血大鼠模型

2 制作技巧

經(jīng)過預(yù)實驗60只和正式實驗的140只大鼠模型的制作，不斷積累經(jīng)驗探索并解決出現(xiàn)的問題，總結(jié)如下腦出血大鼠模型的制作技巧以及手術(shù)過程中注意事項：

2.1實驗時間選擇造模時間盡量選擇冬季，夏季易發(fā)生感染，較冬季成活率低。

2.2麻醉麻醉時，采用新鮮配置的水合氯醛進(jìn)行麻醉，盡量做到麻醉量一次到位，否則大鼠手術(shù)過程中會出現(xiàn)掙扎，嚴(yán)重影響定位精準(zhǔn)度，如劇烈掙扎無法進(jìn)行手術(shù)操作再補麻藥時，補充劑量很難拿捏，很容易造成過量麻醉死亡，無形之間增加了實驗成本。

2.3固定每次使用立體定位儀前，務(wù)必校準(zhǔn)調(diào)零，定位大鼠過程中，一定要將大鼠頭部牢固固定，防止手術(shù)過程中因大鼠掙扎而使定位不精準(zhǔn)、血腫部位有偏差，但同時也要注意不要因固定過緊影響大鼠呼吸，造成大鼠缺氧死亡。

2.4手術(shù)過程中操作注意

2.4.1 鉆孔之前：在定位完成后鉆孔之前，用黑色記號筆在進(jìn)針點標(biāo)記“十”字符號，“十”字交點即為鉆孔處，因手術(shù)過程中大鼠會出現(xiàn)皮下出血，若出血過多會掩蓋已經(jīng)準(zhǔn)確定位的進(jìn)針點，所以為了避免該情況的發(fā)生而影響實驗進(jìn)程，最好定位后標(biāo)記，節(jié)省時間。

2.4.2 鉆孔時：使用電動顱骨鉆時，右手持儀器，一定要用左手托著右手，因大鼠顱骨相對較薄，容易鉆透，手下稍有落空感即已經(jīng)鉆透。如不用左手抵住，右手懸空，鉆透后由于慣性作用會使右手插入腦組織，導(dǎo)致腦組織嚴(yán)重受損，影響實驗?zāi)Ｐ偷木庑酝瑫r也對大鼠腦組織造成不可逆的損傷。

2.4.3 注入自體血時：如果實驗采用自體注血法，取血操作應(yīng)熟練迅速，以免血液凝固，難于注入。注入自體血和膠原酶的過程中，注入的速度一定要緩慢、均勻，該環(huán)節(jié)也是造模成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如操作不當(dāng)或注入速度過快而引起腦內(nèi)壓力迅速增高，血腫沖破腦室，嚴(yán)重者可直接致死。退針過程中操作務(wù)必緩慢，并且保證注入后讓大鼠靜止10 min，待血腫形成后緩慢推針，以免注入的自體血或膠原酶沿針道反流或流入蛛網(wǎng)膜下腔，造成模型之間存在差異，影響實驗結(jié)果。

2.4.4 術(shù)后感染的預(yù)防：術(shù)后縫合部位碘酒消毒，并腹腔注射青霉素或慶大霉素以防感染，提高模型的成活率，有助于實驗?zāi)茼樌_展。

3 討論

綜上所述，實驗過程中需注意以上細(xì)節(jié)，能有利于實驗的順利開展。采用自體血注入或膠原酶注入法建立大鼠腦出血模型的時候，注入的速度為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，稍有不慎會導(dǎo)致大鼠死亡，目前國外多采用自動化的電子微量注射器，能精準(zhǔn)的掌握注入的速率，但由于設(shè)備價格昂貴，國內(nèi)實驗室普遍采用人工掌握速率注入的方法，很難做到勻速推注，降低了模型的成活率和穩(wěn)定性，還有待于進(jìn)一步發(fā)展。

而對于造模方法的選擇，每種造模方法各有其優(yōu)劣，我們開展動物實驗時要根據(jù)觀測的指標(biāo)和預(yù)期結(jié)果選擇合適的造模方法進(jìn)行實驗，以提高動物實驗的可信度。如：自體血注入法和膠原酶誘導(dǎo)法為目前動物實驗中應(yīng)用相對廣泛的兩種造模方法，如果觀測腦出血早期形成過程以及病理生理形態(tài)學(xué)變化，自體血注入法則更為合適；如果觀測時程較長的功能預(yù)后情況應(yīng)選擇膠原酶誘導(dǎo)模型更為合適。然而目前尚沒有一種模型能完全模擬人類自發(fā)性腦出血的整個過程。理想的腦出血動物模型應(yīng)滿足以下幾點：(1)出血量固定；(2)造成的血腫的范圍固定，壓迫程度固定；(3)與人類腦出血后生理病理狀態(tài)吻合，有利于各種繼發(fā)性損害以及出血后誘導(dǎo)產(chǎn)生的各因子的定性定量研究；(4)簡便廉價易于獲取，可重復(fù)性好等等。

未來探索更為貼近人類生理病理的動物模型，可以嘗試兩種或兩種以上造模方法的合并應(yīng)用，如將自發(fā)性腦出血大鼠模型與人工誘導(dǎo)腦出血大鼠模型相結(jié)合，并做相應(yīng)的改進(jìn)將有可能獲得更加貼近的動物模型，還可以應(yīng)用一些現(xiàn)代超聲技術(shù)，進(jìn)行超聲下穿刺造模，使定位更加精準(zhǔn)模型更加穩(wěn)定，如ZHOU[32]等就利用超聲波對腦血管的顯像作用，在超聲探頭的指引下精準(zhǔn)的制作出犬大腦中動脈出血模型，這對于腦出血大鼠動物模模型的制作也是一種指引。因此，在未來的實驗中，還需要我們不斷探索設(shè)想并付諸于實踐，朝著能建立一種更加貼切穩(wěn)定可重復(fù)性好的動物模型的方向努力，從而推動腦出血實驗研究的進(jìn)展，指導(dǎo)臨床治療。

[1] VAN MATRE E T，SHERMAN D S，KISER T H.Management of intracerebral hemorrhage--use of statins[J].Vasc Health Risk Manag，2016，12：153-161.

[2] 賈建平，陳生弟.神經(jīng)病學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：188-193.

[3] 張玉琴，劉詩翔.腦出血的流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2007(3)：174-176.

[4] 林瀟，倪浩棋，黃李潔，等.常用腦出血動物模型的研究進(jìn)展[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，47(9)：698-703.

[5] 王敏忠，劉雪平，付慶喜，等.大鼠緩慢注射自體血腦出血模型的改良[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2008，25(3)：330-332.

[6] ROSENBERG G A，MUN-BRYCE S，WESLEY M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke，1990，21(5)：801-807.

[7] YANG G Y，BETZ A L，CHENEVERT T L，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats[J].J Neurosurg，1994，81(1)：93-102.

[8] ZENG J，ZHANG Y，MO J，et al.Two-kidney，two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats[J].Stroke，1998，29(8)：1 708-1 713；1 713-1 714.

[9] SINAR E J，MENDELOW A D，GRAHAM D I，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：effects of a temporary mass lesion[J].J Neurosurg，1987，66(4)：568-576.

[10] 周曉春，陳龍，劉紹晨.200只大鼠內(nèi)眥取血的操作體會[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，22(4)：328-329.

[11] 張祥建，劉春燕，祝春華，等.大鼠自體動脈血腦出血動物模型的建立[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2003，11(6)：341-344.

[12] 張昊，馬曉依，呂妍，等.大鼠腦出血模型[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10(34)：88-89.

[13] XI G，KEEP R F，HOFF J T.Erythrocytes and delayed brain edema formation following intracerebral hemorrhage in rats[J].J Neurosurg，1998，89(6)：991-996.

[14] ROPPER A H，ZERVAS N T.Cerebral blood flow after experimental basal ganglia hemorrhage[J].Ann Neurol，1982，11(3)：266-271.

[15] SANSING L H，KASNER S E，MCCULLOUGH L，et al.Autologous blood injection to model spontaneous intracerebral hemorrhage in mice[J].J Vis Exp，2011，24(54)：2 618.

[16] 李紅玲，劉瑞春，緱元沖，等.自體血三次注入法建立腦出血大鼠模型[J].中國康復(fù)理論與實踐，2006，12(8)：651-653.

[17] MANAENKO A，CHEN H，ZHANG J H，et al.Comparison of different preclinical models of intracerebral hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl，2011，111：9-14.

[18] 張朋奇，朱賢立，趙甲山，等.一種大鼠腦內(nèi)出血模型的建立與評價[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2005，10(1)：33-35.

[19] 李東方，趙海濱，姜天元，等.采用Ⅶ型膠原酶制作大鼠腦出血模型的技巧[J].神經(jīng)藥理學(xué)報，2015，5(4)：22-25.

[20] 譚敬，肖新莉，陳新林，等.采用IV型膠原酶建立小鼠腦出血模型[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014(5)：522-525.

[21] ANDALUZ N，ZUCCARELLO M，WAGNER K R.Experimental animal models of intracerebral hemorr-hage[J].Neurosurg Clin N Am，2002，13(3)：385-393.

[22] FUJII Y.Studies on induced hypothermia for open heart surgery.II.Adequate flow of hypothermic perfusion in the dog[J].Nihon Geka Hokan，1972，41(2)：149-159.

[23] KAZUI S，NARITOMI H，YAMAMOTO H，et al.Enlargement of spontaneous intracerebral hemorrhage.Incidence and time course[J].Stroke，1996，27(10)：1 783-1 787.

[24] 段曉春，王中，陳罡.腦出血動物模型研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志，2015(2)：36-39.

[25] 田增有，孟令麗，楊莎莎，等.腦出血模型制作方法研究進(jìn)展[J].河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2012，14(6)：809-810.

[26] KRAFFT P R，ROLLAND W B，DURIS K，et al.Modeling intracerebral hemorrhage in mice：injection of autologous blood or bacterial collagenase[J].J Vis Exp，2012(67)：e4289.

[27] 王哲，劉震，劉昕，等.兩種實驗性大鼠腦出血模型的對比研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2016，38(13)：1 494-1 500.

[28] LOPEZ V E，HERNANDEZ L A，CALANDRE L，et al.Time window for clinical effectiveness of mass evacuation in a rat balloon model mimicking an intraparenchymatous hematoma[J].J Neurol Sci，2000，174(1)：40-46.

[29] OGATA J，F(xiàn)UJISHIMA M，TAMAKI K，et al.Stroke-prone spontaneously hypertensive rats as an experimental model of malignant hypertension.I.A light-and electron-microscopic study of the brain[J].Acta Neuropathol，1980，51(3)：179-184.

[30] 魯華山，于長義，田志佳，等.腦出血實驗動物模型研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2016，15(2)：184-186.

[31] CHELKO S P，SCHMIEDT C W，LEWIS T H，et al.A novel vascular clip design for the reliable induction of 2-kidney，1-clip hypertension in the rat[J].J Appl Physiol(1985)，2012，112(3)：362-366.

[32] ZHOU X，CHEN L，F(xiàn)ENG C，et al.Establishing an animal model of intracerebral hemorrhage under the guidance of ultrasound[J].Ultrasound Med Biol，2013，39(11)：2 116-2 122.