常博文　劉　杰　鐘　鵬　郭曉瑞

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源研究所，哈爾濱　150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱　150040)

長春花(Catharanthusroseus(L.) G.Don)是夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬(Catharanthus)多年生草本或亞灌木花卉[1]，它不僅具有觀賞價值，也是具有多種功效的藥用植物。長春花植株藥用價值主要來自其體內(nèi)含有的100多種萜類吲哚生物堿[2～3]如文多靈[4](Vindoline，VIN)、長春質(zhì)堿[5](Catharanthine，CAT)、阿瑪堿[6](Ajmalicine)，特別是一些具有抗腫瘤功效的藥用成分如長春堿[7～8](Vinblastine，VINB)。生物堿在長春花中共同前體異胡豆苷(Strictosidine，STR)是由莽草酸途徑中的色胺和類萜途徑的裂環(huán)馬錢子苷在異胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase，str)的催化下合成[9](圖1)，異胡豆苷的含量一定程度上決定了下游生物堿的含量。異胡豆苷經(jīng)過多步酶促反應(yīng)合成單萜生物堿文多靈和長春質(zhì)堿，這兩種生物堿在過氧化物酶(CrPRX)的催化下合成二萜生物堿長春堿，由于目前尚無工業(yè)化生產(chǎn)長春堿等化合物的技術(shù)，所以研究提高長春花中長春堿和長春新堿的處理方法是關(guān)鍵。

圖1　長春花中長春堿合成途徑Fig.1　The biosynthetic pathway of vinblastine in C.roseus

乙烯是一種氣體植物激素，廣泛存在于植物生長的各個時期調(diào)控植物生長發(fā)育過程和抵御外界不良條件的應(yīng)答反應(yīng)。乙烯應(yīng)答因子(Ethylene-response factor，ERF)是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與到植物種子萌發(fā)、生長、開花、衰老和抵御非生物脅迫的過程中[10～14]，同時在植物次生代謝物合成方面也起到重要作用[15～16]。已有研究表明，外源施加乙烯能夠促進長春花中生物堿的積累，并且施加乙烯濃度不同時生物堿含量也有所差異[17]；另外，外施乙烯也影響植物體內(nèi)生理生化過程，例如外施乙烯氣體時植物光合速率下降，促進葉綠素降解[18～19]。但對于外源乙烯處理下花生生理生化水平與生物堿之間相關(guān)性的研究還未見報道。

針對以上問題，本研究使用乙烯利作為乙烯釋放劑，對外源乙烯處理下長春花生長、光合作用強度、活性氧含量和長春堿等生物堿含量進行研究并進行相關(guān)性分析，研究結(jié)果為長春堿及其前體化合物生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及處理

試驗所用長春花種子來自位于浙江富陽市的杭州海正藥用植物有限公司種植基地。長春花培養(yǎng)和樣品處理在實驗室中進行，使用人工氣候箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度為28℃(日)/25℃(夜)，光照14 h，濕度為80%。使用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌長春花幼苗，生長至3對真葉完全展開后開始進行乙烯利處理。

1.2　試驗方法

1.2.1生長指標(biāo)測定

乙烯利易溶于水，在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入乙烯利粉末(Sigma，USA)使其最終濃度為100 μmol·L-1，長春花幼苗在含100 μmol·L-1乙烯利營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d，記錄每天長春花生長指標(biāo)，包括：株高、根長、根重、單株生物量等。

1.2.2乙烯釋放量測定

方法參照文獻15。對照組和處理組隨機選取5株樣本，長春花幼苗進行100 μmol·L-1乙烯利處理0.5、1、2、3 h，每株放入相同體積的密閉容器中，吸取20 mL密閉容器中的氣體，使用氣相色譜儀(Agilent Technologies,7890A GC Systems)檢測乙烯釋放量。

1.2.3光合作用指標(biāo)測定

長春花幼苗進行100 μmol·L-1乙烯利處理4 d，測定處理前后光合參數(shù)。在晴朗的天氣中使用便攜式光合儀(LI-6400，LI-COR，美國)進行測量(光強為1000 μmol·m-2·s-1；CO2濃度為400 μmol·mol-1；葉溫25±2℃)，記錄凈光合速率(Pn)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)。

1.2.4生物堿含量測定

異胡豆苷、長春質(zhì)堿、文多靈和長春堿含量檢測方法參考文獻[20]。長春花幼苗進行100 μmol·L-1乙烯利處理4 d，每天取樣。稱取烘干的長春花葉片粉末0.3 g，加入5 mL甲醇，超聲提取20 min，離心并提取上清液，減壓濃縮揮干。甲醇溶解定容至1.5 mL，使用0.45 μm微孔濾膜過濾后供高效液相色譜(HPLC)檢測。

1.2.5基因表達量檢測

處理和取樣參考1.2.2。RNA提?。?00 mg樣本凍干粉加入1 mL TRIzol反應(yīng)液，使用RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取總RNA，NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies)測定OD260/OD280檢測RNA純度。將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，方法參考TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，采用20 μL體系。反轉(zhuǎn)得到的cDNA稀釋10倍后，以qRT-PCR設(shè)計的引物(表1)進行qRT-PCR反應(yīng)和檢測，選用長春花actin基因作為內(nèi)參基因。

1.2.6統(tǒng)計分析

本研究所有試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 17.0軟件，并采用單因素方差分析( One-Way ANOVA)檢驗各處理間的差異顯著性，制圖使用Excel 進行。

表1　基因引物序列

2　實驗結(jié)果

2.1　外源乙烯對長春花乙烯釋放量和erf基因表達的影響

乙烯利被植物細胞吸收之后進行分解，釋放乙烯。為了驗證外源施加的乙烯利是否在植物內(nèi)發(fā)揮作用，所以檢測了長春花乙烯釋放量和erf基因表達量(圖2)。隨著乙烯利處理時間的增加，長春花乙烯釋放量逐漸加大，對照組(CK)植株的乙烯釋放量基本為0，處理30 min后乙烯釋放量急劇增長，處理3h后測定的乙烯峰面積為12.33，說明乙烯釋放量隨著處理時間的延長一直積累。

圖2　乙烯利處理對長春花乙烯釋放量和erf基因表達的影響　字母表示erf基因表達量之間的差異顯著性。Fig.2　The effect of ethephon treatment on ethylene release amount and erf gene expression in C.roseus　The letters represent the significance of difference in erf gene expression between treatments.

圖3　乙烯利處理對長春花中生物堿合成的影響Fig.3　The effect of ethephon on the accumulations of alkaloids in C.roseus

ERF轉(zhuǎn)錄因子是乙烯信號途徑中調(diào)控植物乙烯反應(yīng)的關(guān)鍵，所以erf基因的表達量可以反映外源乙烯的施加對長春花內(nèi)源乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。乙烯利處理對長春花erf基因表達影響很大。由圖2可以看出，隨著乙烯利處理時間的延長，erf基因表達量顯著升高(P<0.05)。處理時間為0.5～2 h時，erf表達量顯著急劇上升(P<0.05)；處理3 h后，erf表達量是對照組的8.9倍。

2.2　外源乙烯對長春花生物堿含量的影響

檢測乙烯利處理后長春花中4種重要生物堿含量(圖3)，結(jié)果表明：處理1～3天時，乙烯利處理組的長春堿含量與未施加處理的對照組的差異不明顯；處理3～4天后，乙烯利處理組的長春堿含量顯著高于對照組。

2.3　外源乙烯對長春花生物堿合成途徑關(guān)鍵酶基因表達的影響

為了進一步驗證乙烯對長春花長春堿生物合成的影響，檢測了長春堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因(str，CrPRX)的表達量(圖4)。乙烯處理后str和CrPRX基因表達量顯著上升，str基因表達量是對照的3.44倍，CrPRX基因表達量上升了167%。

圖4　乙烯利處理對長春花中生物堿合成途徑關(guān)鍵酶基因str、CrPRX表達量的影響Fig.4　The effect of ethephon on the expression of key enzyme genes(str,CrPRX) in alkaloids biosynthesis pathway in C.roseus

2.4　外源乙烯對長春花植株生長的影響

乙烯利處理影響長春花生長(表2)，結(jié)果表明：與對照組相比，處理組隨著乙烯利施加時間積累，長春花單株生物量和株高被抑制，根長和根重影響不顯著與對照組相似，莖稈直徑增加。乙烯利處理4 d后，單株生物量和株高分別下降了2.7%、4.9%；莖稈直徑增加了4.8%。

2.5　外源乙烯對長春花光合作用的影響

對比乙烯利處理前后長春花光合作用參數(shù)(表3)，結(jié)果表明：與對照組相比，處理組凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率都呈下降趨勢，胞間CO2濃度卻上升。凈光合速率下降幅度較大，約下降了38.9%，其次是氣孔導(dǎo)度下降10.9%，蒸騰速率下降了9.3%，胞間CO2濃度上升了19.3%。

表2　乙烯利處理對長春花生長的影響

表3乙烯利處理對長春花光合作用的影響

Table3TheeffectofethephonontheaccumulationsofalkaloidsinC.roseus

光合作用參數(shù)Photosynthesisparameter對照組Control100μmol·L-1乙烯利處理100μmol·L-1treatment凈光合速率Netphotosyntheticrate5.821±0.938a3.557±0.301b氣孔導(dǎo)度Stomatalconductance0.129±0.017a0.115±0.026a胞間CO2濃度IntercellularCO2concentration373.521±14.958a445.522±26.097b蒸騰速率Transpirationrate1.855±0.152a1.696±0.138a

2.6　生物堿、光合參數(shù)和生長指標(biāo)之間相關(guān)性

分析乙烯利處理4 d前后長春花生物堿、光合參數(shù)和生長指標(biāo)之間的相關(guān)性(表4)，表明3種生物堿之間存在顯著正相關(guān)性(P<0.05)。分析光合參數(shù)與生物堿之間相關(guān)性，表明凈光合速率與3種生物堿呈顯著負相關(guān)性(P<0.05)；氣孔導(dǎo)度與長春堿、文多靈之間顯著負相關(guān)(P<0.05)，但與長春質(zhì)堿相關(guān)性不顯著。生長指標(biāo)中莖稈直徑與3種生物堿之間存在顯著正相關(guān)性(P<0.05)，株高與3種生物堿之間顯著負相關(guān)(P<0.05)，單株生物量與長春堿、文多靈之間存在顯著負相關(guān)性(P<0.05)，但與長春質(zhì)堿之間相關(guān)性不顯著。光合參數(shù)與生長指標(biāo)相關(guān)性分析表明凈光合速率與單株生物量、莖稈直徑、株高之間存在顯著相關(guān)性，氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度與生長指標(biāo)相關(guān)性不顯著。

表4生物堿、光合參數(shù)和生長指標(biāo)之間相關(guān)性分析

Table4Thecorrelationanalysisofalkaloids,photosyntheticparametersandgrowthindexes

生物堿Alkaloids光合參數(shù)Photosynthesisparameter生長指標(biāo)GrowthindexesVINBVINCATPnGsCiBSDHVINB1 VIN0.962**1 CAT0.900*0.924**1 Pn-0.993**-0.978**-0.914*1 Gs-0.871*-0.869*-0.7240.875*1 Ci0.6060.6460.372-0.652-0.6111 B-0.832*-0.830*-0.6420.842*0.644-0.864*1 SD0.887*0.927**0.871*-0.887*-0.6540.554-0.859*1 H-0.918**-0.858*-0.891*0.929**0.688-0.5560.768-0.7861

*P<0.05；**P<0.01

3　討論

長春花可產(chǎn)生大量的萜類吲哚生物堿(TIAs)具有重要的藥理作用，目前分離和鑒定出130多種TIAs[21]，其中長春堿這種二萜生物堿具有抗腫瘤的功效，長春花是醫(yī)療上應(yīng)用廣泛的抗癌藥物主要原料之一。長春堿體外合成具有種種技術(shù)限制，目前臨床上的長春堿主要以人工種植為主要來源之一。由于植物體內(nèi)含量較少，所以如何提高長春花中長春堿的產(chǎn)量，是長春花人工種植值得研究的問題[22]。乙烯利在農(nóng)業(yè)上是一種植物調(diào)節(jié)劑，通過植物吸收后在細胞內(nèi)分解為乙烯分子[23]，通過外部施加乙烯利提高內(nèi)源乙烯含量，與本研究結(jié)果一致。乙烯利處理也促進乙烯信號響應(yīng)因子基因erf轉(zhuǎn)錄(圖2)，erf基因上調(diào)表達反映了外源乙烯利處理使細胞內(nèi)乙烯信號加強。

前人和本研究都發(fā)現(xiàn)外源乙烯處理能夠使長春花中生物堿含量升高[15]。異胡豆苷含量在乙烯處理下顯著升高，并且催化異胡豆苷合成的關(guān)鍵酶基因str也顯著上調(diào)表達(圖3～4)，說明乙烯調(diào)控通過調(diào)控異胡豆苷合成酶的含量來促進異胡豆苷合成。文多靈和長春質(zhì)堿對于乙烯利處理較為敏感，處理1天后這兩種生物堿含量就顯著升高(P<0.05)，長春堿作為文多靈和長春質(zhì)堿縮合形成的二萜生物堿，在處理1～2天時含量與對照組沒有明顯差異，這可能與這條合成途徑上的限速酶含量有關(guān)。處理3～4天后長春堿含量顯著高于對照組，Wang等研究表明施加乙烯利處理使長春堿含量升高可能是通過在轉(zhuǎn)錄水平上促進長春堿的合成酶CrPrx基因上調(diào)表達來實現(xiàn)的[15]，與本研究結(jié)果一致，但ERF轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控CrPrx基因的表達尚不清楚需要進一步研究。

乙烯對植物伸長生長具有抑制作用，這是因為乙烯在光照下和黑暗中都抑制細胞伸長[24]，研究表明乙烯對伸長生長的抑制作用主要是通過調(diào)節(jié)細胞骨架重排[24～27]、細胞壁松弛[27～29]和吸收水分增加膨壓的途徑。本研究表明乙烯利處理后長春花株高和單株生物量有顯著下降，根長也有所下降，但下降幅度不明顯；另外乙烯利處理組的莖稈直徑明顯高于對照組(表2)。

氣孔參與植物光合作用和水分代謝，是植物體內(nèi)與外界環(huán)境之間氣體和水分交換的重要媒介。前人對不同處理時間下外源乙烯調(diào)控植物氣孔運動的研究表明乙烯通過促進擬南芥葉片中H2O2合成誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[30～33]，也可以誘導(dǎo)番茄和蠶豆氣孔關(guān)閉[34]。本研究結(jié)果顯示乙烯利處理后，長春花氣孔導(dǎo)度(Gs)下降(表3)，表明外源乙烯處理誘導(dǎo)長春花葉片氣孔關(guān)閉。乙烯利處理后凈光合速率(Pn)低于對照組，但胞間CO2濃度(Ci)高于對照組，說明適于非氣孔因素導(dǎo)致的凈光合速率下降。凈光合速率與長春花單株生物量、株高和莖稈直徑生長與生物堿之間存在明顯相關(guān)性，推測單株生物量下降與凈光合速率減弱有關(guān)。

分析生物堿、光合參數(shù)和生長指標(biāo)之間的相關(guān)性(表4)，可以看出凈光合速率與單株生物量(B)和株高(H)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，但與莖稈直徑(SD)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，推測是由于凈光合速率降低導(dǎo)致植物生物量下降。另外，分析表明凈光合速率與長春堿(VIB)、文多靈(VIN)和長春質(zhì)堿(CAT)之間呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。生物堿的含量與長春花的生長指標(biāo)之間也存在顯著相關(guān)性，這主要與乙烯對植物生長的影響有關(guān)。由相關(guān)性分析結(jié)果可知，單株生物量與長春堿、文多靈呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，株高與長春堿、文多靈和長春質(zhì)堿呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，長春花莖稈直徑與長春堿、文多靈和長春質(zhì)堿呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。乙烯合成調(diào)控因子和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控因子已經(jīng)證實可以上調(diào)植物次生代謝物含量[35～37]。隨著外源乙烯的處理，單株生物量和株高受到抑制，但次生代謝物含量增加，在代謝水平上推測外源乙烯促進次生代謝物合成，抑制與次生代謝途徑無關(guān)的初生代謝物，但需要進一步驗證。

4　結(jié)論

外源乙烯利促進長春花內(nèi)部乙烯含量上升，誘導(dǎo)乙烯信號途徑下游erf基因表達。外源乙烯抑制長春花生物量積累、莖根伸長生長，但促進莖稈直徑增加，對根重影響不大。乙烯利處理4天后長春花凈光合速率、氣孔導(dǎo)度下降，胞間CO2濃度上升，說明是非氣孔因素導(dǎo)致凈光合速率下降。乙烯處理下生理指標(biāo)與生物堿含量之間存在明顯的相關(guān)性。凈光合速率與長春花單株生物量、株高和莖稈直徑生長與生物堿之間存在明顯相關(guān)性。乙烯利處理促進長春質(zhì)堿、文多靈和長春堿等次生代謝產(chǎn)物積累，同時也促進長春堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因str和CrPRX上調(diào)表達。長春堿、文多靈、長春質(zhì)堿與單株生物量和株高負相關(guān)，與莖稈直徑顯著正相關(guān)。

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