李艷霞　鄧繼峰　李桂君*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱　150081； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽　110866)

莖尖組織培養(yǎng)具有培養(yǎng)時間短，繁殖倍數(shù)高，不受季節(jié)影響的特點，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、果樹、花卉等領(lǐng)域[1～3]。通過微莖尖培養(yǎng)直接誘導(dǎo)成苗，不僅可以獲得無病毒植株，還可用于種質(zhì)資源保存、遺傳轉(zhuǎn)化等多種研究[4～5]。

越橘(Vacciniumvitis-idaeaL.)是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生漿果類植物[6]。果實富含維生素、有機酸、糖類、微量元素和類黃酮等[7]，具有抗菌消炎、抗氧化、防癌、預(yù)防心血管疾病、改善視力和增強免疫力等作用[8]，是集營養(yǎng)、藥用和經(jīng)濟價值為一體的經(jīng)濟林樹種，近年來倍受人們的關(guān)注。

目前國外已經(jīng)培育出了近百個越橘優(yōu)良品種，且已形成了產(chǎn)業(yè)化。雖然我國對越橘的研究、開發(fā)和利用較晚，但在種質(zhì)資源收集、引種栽培、繁殖等方面取得了一定進展。各類越橘的繁殖方法不同，但組織培養(yǎng)法更能適合越橘快速發(fā)展的需要[9]，在國外通過莖尖培養(yǎng)獲得脫病毒苗，在生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。國內(nèi)有關(guān)越橘組織培養(yǎng)主要有，金彥磊等[10]和田新華[11]等對越橘葉片、子葉、胚軸、腋芽及莖段為外植體的組培快繁進行了研究。而對越橘微莖尖進行離體培養(yǎng)缺乏系統(tǒng)研究。因此，本研究以越橘為材料，旨在建立越橘莖尖離體培養(yǎng)及植株再生組培體系，為越橘無病毒苗繁育、種質(zhì)資源保存以及商業(yè)化生產(chǎn)等奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　外植體消毒

剪取當年生越橘優(yōu)樹嫩梢，用自來水沖洗30 min。在超凈工作臺上，用75%的酒精溶液消毒30 s，無菌水沖洗2次，轉(zhuǎn)到0.1%升汞溶液中滅菌5～8 min，再用無菌水沖洗5次，最后用無菌濾紙吸干表面水份備用。

1.2　培養(yǎng)基篩選試驗

分別以MS、WPM、改良的WPM(用708 mg·L-1的Ca(NO3)2·4H2O、202 mg·L-1的KNO3代替WPM培養(yǎng)基中的CaCl2和K2SO4)為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別添加ZT 0.05 mg·L-1、GA30.1 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1，蔗糖20 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH值5.4。在超凈工作臺上，于解剖鏡下剝?nèi)в?～2個葉原基的莖尖接種在以上培養(yǎng)基上，每瓶接種6個莖尖，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)，共接種90個莖尖。進行暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為25±2℃，光照培養(yǎng)時光周期為14 h·d-1，光照強度為2 200 lx，以下實驗條件均與此相同。2個月后統(tǒng)計成苗率及生長情況。

1.3　激素誘導(dǎo)試驗

在超凈工作臺上，于解剖鏡下剝?nèi)в?～2個葉原基的莖尖迅速接種于改良的WPM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中分別添加0.01、0.05、0.08、0.1 mg·L-1的ZT(反式玉米素)，添加0.1、0.5、1.0 mg·L-1的IBA，添加0.1 mg·L-1的GA3。

1.4　莖尖長度試驗

分別剝?nèi)?.1～0.3、0.3～0.5、0.5～0.7和0.7～1.0 mm的莖尖迅速接種到WPM(改良)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中分別添加ZT 0.05 mg·L-1、GA30.1 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1。

1.5　增殖培養(yǎng)試驗

將由小莖尖誘導(dǎo)的植株切成1～1.5 cm長的段，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以WPM(改良)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加0.1、0.2 mg·L-1的GA3，0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1的ZT一個月后統(tǒng)計增殖倍數(shù)及生長情況。

1.6　生根移栽

選取增殖繼代培養(yǎng)2～3次的健壯試管苗在溫室中煉苗，3～4 d后成簇取出(帶有愈傷組織)，用清水沖洗基部，去除培養(yǎng)基。在濃度為500 mg·L-1的IBA中浸泡5 min，用消毒的水苔包裹苗，僅露出1/3～1/4頂部，栽到96孔的小營養(yǎng)缽誘導(dǎo)生根，用透光的塑料薄膜拱棚保溫保濕，相對濕度控制在85%左右，溫度控制在25℃，誘導(dǎo)生根，40 d調(diào)查生根率。移栽基質(zhì)為草炭∶蛭石(體積比)=2∶1組成的基質(zhì)。

1.7　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

按下列方法統(tǒng)計莖尖離體培養(yǎng)成苗率以及增殖系數(shù)：

莖尖成苗率=(莖尖成活數(shù)/接種莖尖數(shù))×100%

(1)

叢生芽增殖系數(shù)=誘導(dǎo)出叢生芽總數(shù)/誘導(dǎo)出叢生芽的外植體數(shù)

(2)

2　結(jié)果與分析

2.1　培養(yǎng)基種類對莖尖生長的影響

莖尖接種到3種培養(yǎng)基上后，成苗率有顯著差異(表1)。接種到MS培養(yǎng)基上的莖尖誘導(dǎo)的苗生長較弱、淡黃。莖尖接種到改良的WPM培養(yǎng)基上比接種在MS以及WPM培養(yǎng)基上生長健壯，莖尖誘導(dǎo)成苗率達到84.5%，因此WPM(改良)培養(yǎng)基為莖尖誘導(dǎo)成苗的最佳培養(yǎng)基。

表1培養(yǎng)基類型對莖尖生長的影響

Table1TheeffectsofdifferentmediumtypesonV.vitis-idaeastemapexgrowth

處理Treatment培養(yǎng)基類型Mediumtype接種莖尖數(shù)(個)Inoculatedstemapexnumber成苗率Seedlingrate(%)生長情況Growingstates1MS6068.2b較弱、淡黃Weak,yellowish2WPM6076.4ab生長緩慢Poorgrowth3WPM(改良)WPM(Improved)6084.5a健壯Strong

注：同一列不同字母表示在P<0.05水平下差異顯著性下同。

Note:The different letters at the same column are significant atP<0.05 level.The same as below.

2.2　激素對越橘莖尖誘導(dǎo)的影響

越橘莖尖接種到培養(yǎng)基后，10 d左右莖尖生長點開始轉(zhuǎn)綠，2個月左右由莖尖誘導(dǎo)的芽長度可達0.8～1.0 cm，但不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖尖生長情況各異。由表2～3可見，在莖尖誘導(dǎo)過程中，激素配比對莖尖誘導(dǎo)成苗率有顯著影響。ZT濃度對莖尖分化有很大影響，隨著ZT濃度的增高，莖尖誘導(dǎo)產(chǎn)生的簇狀芽數(shù)量也隨之增多；ZT濃度為0.1 mg·L-1以下時，莖尖誘導(dǎo)產(chǎn)生芽的數(shù)量隨之減少，莖尖大多為單芽。在莖尖誘導(dǎo)過程中，IBA濃度對莖尖生長也有很大影響，IBA濃度達到1.0 mg·L-1時，莖尖生長受抑制，長勢差。處理8能夠誘導(dǎo)獲得健壯的單芽成苗，成苗率為91.2%。處理13和14雖然成苗率也很高，而且可以誘導(dǎo)簇狀芽，但幼芽不健壯。因此以處理8WPM(改良)+ZT 0.05 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1為越橘莖尖誘導(dǎo)最佳激素及濃度配比組合。

表2不同激素對越橘莖尖誘導(dǎo)的方差分析

Table2TheANOVAanalysisofdifferenthormoneonV.vitis-idaeastemapexinduced

處理Treatment平方和Thesumofsquare自由度Degreesoffreedom均方MeansquareFPr>PZT1078.1883359.3964.526*0.028IBA824.6842412.425.193*0.022ZT×IBA1246.0176207.952.618*0.0411誤差Error1905.7242479.405

表3　不同激素對越橘莖尖誘導(dǎo)的影響

表4不同長度莖尖誘導(dǎo)分化成苗率

Table4Theseedlingrateofdifferentlengthofstemapexinduction

處理Treatment莖尖長度Thelengthofstemapex(mm)葉原基數(shù)(個)Leafprimordiumnumber成苗率Seedlingrate(%)成苗時間Seedlingtime(d)160.1～0.3128C60～68170.3～0.5268B55～60180.5～0.7279AB50～54190.7～1.0294A45～50

注：同一列不同字母表示在P<0.01水平下差異顯著性。

Note:The different letters at the same column are significant atP<0.01 level.

2.3　莖尖長度對誘導(dǎo)成苗率的影響

由表4可見，莖尖的大小直接影響著誘導(dǎo)成苗率，莖尖越大成苗率越高，成苗時間越短。當越橘莖尖長度為0.1～0.3 mm時莖尖成苗率僅為28%，成苗時間需要60～68 d；莖尖長度達到0.3～0.5 mm時，莖尖成苗率為68%，成苗時間為55～60 d；莖尖長度達到0.5～0.7 mm時，莖尖成苗率為79%，成苗時間為50～54 d；當莖尖長度為0.7～1.0 mm時，莖尖成活率高達94%，成苗時間為45～50 d。

2.4　增殖培養(yǎng)

將越橘莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)的苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，一個月調(diào)查叢生芽增殖系數(shù)及生長情況。由表5可見，不同濃度的ZT和GA3對苗的增殖和高生長有顯著影響。在增殖培養(yǎng)過程中，不定芽的增殖系數(shù)隨著ZT濃度的升高呈先升高而后下降的趨勢ZT濃度在0.5～1.5 mg·L-1范圍內(nèi)，ZT濃度為0.5 mg·L-1時，苗的增殖系數(shù)最低為2.2，隨著ZT濃度升高，苗增殖系數(shù)增加；當ZT為2.0 mg·L-1時，苗的增殖降低為3.1倍；GA3濃度對苗的高生長有一定影響，當濃度達到0.1時苗健壯，當濃度達到0.2時越橘生長有抽長現(xiàn)象。綜合增殖系數(shù)、苗高以及生長情況，處理21WPM(改良)+ZT 1.0 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1為最佳增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為3.8倍，苗高為2.44 cm，生長健壯。

表5　激素對幼苗增殖的影響

2.5　生根與移栽

選取增殖繼代培養(yǎng)2～3次的健壯試管苗，溫室中煉苗3～4 d后成簇取出(帶有愈傷組織)，用清水沖洗基部，去除培養(yǎng)基。在濃度為500 mg·L-1的IBA中浸泡5 min，用消毒的水苔包裹苗，僅露出1/3～1/4頂部，栽到96孔的小營養(yǎng)缽誘導(dǎo)生根，用透光的塑料薄膜拱棚保溫保濕，相對濕度控制在85%左右，溫度控制在25℃，誘導(dǎo)生根，40 d后生根率達76.2%，平均根長1.44 cm。苗木生根后連同水苔一起移栽到草炭∶蛭石(體積比)=2∶1組成的基質(zhì)中，對濕度控制在65%左右，溫度控制在25℃左右，移栽初期適當遮蔭，防治陽光直射，以后逐漸增加日照時間和強度，同時注意通風，移栽成活率達85.9%。

3　討論

植物激素是影響植物的關(guān)鍵因子之一，在組織培養(yǎng)中起重要作用，選擇適宜的激素以及激素濃度極其關(guān)鍵[12～13]。Julia Meiners[14]等研究發(fā)現(xiàn)ZT對越橘的初始誘導(dǎo)以及增殖培養(yǎng)有主導(dǎo)作用。段祖安[15]等側(cè)芽進入初代培養(yǎng)時，在0.5～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，ZT濃度越高側(cè)芽生長越好。本研究通過對越橘莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，ZT濃度低于0.1 mg·L-1有利于莖尖誘導(dǎo)形成單芽，ZT濃度達到0.5 mg·L-1時，有利于組織分化形成叢生芽。越橘莖尖接種在WPM(改良)+ZT 0.05 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1的培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)產(chǎn)生健壯的芽。增殖培養(yǎng)階段，ZT濃度在0.5～1.5 mg·L-1范圍內(nèi)，適當?shù)靥岣咂錆舛?，則有利于提高繁殖系數(shù)。當ZT濃度超過1.5 mg·L-1時，增殖系數(shù)降低，有效芽數(shù)量減少。越橘不同組培階段所需激素濃度有一定差異，分析產(chǎn)生這種差異的原因，可能與外植體不同有很大因素。

莖尖大小是影響成苗率的重要因素，莖尖越大成苗率越高，相反莖尖越小成苗率越低[16]。進行越橘莖尖培養(yǎng)時，采用0.1～0.3 mm長的莖尖，成苗率28%；采用0.3～0.5 mm長的莖尖，成苗率能達到68%；莖尖長度達到0.5～0.7 mm時，莖尖成苗率為79%；當莖尖長度為0.7～1.0 mm時，莖尖成苗率高達94%。另外，越橘莖尖越小成苗時間越長，莖尖越大成苗時間越短，浦艷吉[13]對歐洲李和櫻桃李莖尖的研究中也得到同樣的結(jié)論。

與其他外植體如莖段、葉片等誘導(dǎo)相比，以微莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)，可以減少污染，防止品種退化，由莖尖直接誘導(dǎo)成苗，還能夠減少變異。另外，微莖尖培養(yǎng)還是脫毒技術(shù)的基礎(chǔ)。利用越橘莖尖進行離體誘導(dǎo)、增殖及生根移栽是一套完整的技術(shù)，可為今后脫毒研究提供基礎(chǔ)。

1.陸春霞,梁貴秋,唐燕梅.馬鈴薯莖尖脫毒、復(fù)壯及病毒檢測研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,35(1):111-114.

Lu C X,Liang G Q,Tang Y M.Recovery of virus-free potato plant through meristem of apex stem and virus-free detection[J].Journal of Southwest China Normal University:Natural Science Edition,2010,35(1):111-114.

2.謝璇,許軻,謝閩新,等.蘋果莖尖培養(yǎng)快繁體系的優(yōu)化[J].植物生理學(xué)報,2015,51(12):2152-2156.

Xie X,Xu K,Xie M X,et al.Optimization of rapid micropropagation system of apple meristem-tip culture[J].Plant Physiology Journal,2015,51(12):2152-2156.

3.尤燕平,彭詩怡,朱文瑩,等.莖尖培養(yǎng)法脫除菊花B病毒的研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,36(5):144-148.

You Y P,Peng S Y,Zhu W Y,et al.Study on the elimination ofChrysanthemumvirusB by using meristem-tip culture[J].Journal of Nanjing Agricultural University,2013,36(5):144-148.

4.王淼淼,馬曉月,張學(xué)英,等.蘋果抗寒矮化砧木71-3-150莖尖培養(yǎng)快繁體系建立[J].西部林業(yè)科學(xué),2014,43(6):44-47.

Wang M M,Ma X Y,Zhang X Y,et al.Study on rapid micropropagation technique of shoot tip culture of cold-resistant apple dwarf rootstock 71-3-150[J].Journal of West China Forestry Science,2014,43(6):44-47.

5.甘專,劉偉,馬孟增,等.毛葡萄莖尖的離體培養(yǎng)與植株再生[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,26(3):1164-1168.

Gan Z,Liu W,Ma M Z,et al.Invitroshoot-tip culture and regeneration ofVitisheyneana[J].Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2013,26(3):1164-1168.

6.Lehtonen H M,Lehtinen O,Suomela J P,et al.Flavonol glycosides of sea buckthorn(Hippophaёrhamnoidesssp.sinensis) and lingonberry(Vacciniumvitis-idaea) are bioavailable in humans and monoglucuronidated for excretion[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(1):620-627.

7.祖桂芳,趙曉紅,崔勝楠.紅豆越桔活性成分研究及開發(fā)利用[J].生命科學(xué),2009,21(1):151-155.

Zu G F,Zhao X H,Cui S N.Research of active substances aboutVacciniumvitis-idaeaL. and its development and application[J].Chinese Bulletin of Life Sciences,2009,21(1):151-155.

8.Andres-Lacueva C,Shukitt-Hale B,Galli R L,et al.Anthocyanins in aged blueberry-fed rats are found centrally and may enhance memory[J].Nutritional Neuroscience,2005,8(2):111-120.

9.邢瑞丹,劉慶忠,陳新,等.越橘組織培養(yǎng)及基因工程的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(20):9369-9371.

Xing R D,Liu Q Z,Chen X,et al.Research progress on tissue culture and gene engineering of blueberry[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2009,37(20):9369-9371.

10.金彥磊,王秀華,楊永富,等.越橘離體培養(yǎng)的組織學(xué)研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2009,21(1):25-29.

Jin Y L,Wang X H,Yang Y F,et al.Histological studies on morphogenesis ofVacciniumvitis-idaeaculturedinvitro[J].Journal of Heilongjiang August First Land Reclamation University,2009,21(1):25-29.

11.田新華,邢亞娟,張建瑛,等.紅豆越橘離體培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究[J].森林工程,2015,31(2):57-60.

Tian X H,Xing Y J,Zhang J Y,et al.Study on key techniques ofinvitroculture fromVaccinniumvitis-idaeaL.[J].Forest Engineering,2015,31(2):57-60.

12.Hammatt N.Promotion by phloroglucinol of adventitious root formation in micropropagated shoots of adult wild cherry(PrunusaviumL.)[J].Plant Growth Regulation,1994,14(2):127-132.

13.浦艷吉,李國懷,姚延興,等.李莖尖離體培養(yǎng)與植株再生[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,28(2):214-217.

Pu Y J,Li G H,Yao Y X,et al.Shoot-tipsinvitroculture and regeneration of plum[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2009,28(2):214-217.

14.Meiners J,Melanie S,Szankowski I.Efficient in vitro regeneration systems forVacciniumspecies[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2007,89(2-3):169-176.

15.段祖安,李建華,強薇,等.越桔品種‘達柔’離體培養(yǎng)快繁技術(shù)體系的研究[J].山農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,39(4):506-510.

Duan Z A,Li J H,Qiang W,et al.Tudy on system of exbody culture and rapid propagation ofVaccinium‘Darong’[J].Journal of Shandong Agricultural University:Natural Science,2008,39(4):506-510.

16.Manganaris G A,Economou A S,Boubourakas I N,et al.Elimination of PPV and PNRSV through thermotherapy and meristem-tip culture in nectarine[J].Plant Cell Reports,2003,22(3):195-200.