秦　慧,季　斌,王家樂(lè),舒垚榮,楊雨婷

(武漢科技大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院,湖北 武漢 430065)

Al作為地殼中含量最豐富的金屬元素,被廣泛應(yīng)用于高品質(zhì)合金、涂料和電纜等眾多消費(fèi)品中．Al能引起細(xì)胞過(guò)氧化,低濃度下導(dǎo)致植物細(xì)胞程序性死亡,高濃度下引起細(xì)胞壞死,從而抑制植物根系生長(zhǎng)[1]．對(duì)于動(dòng)物而言,長(zhǎng)時(shí)間暴露于鋁脅迫可導(dǎo)致腦衰老與神經(jīng)退化等疾病[2]．低于3 mmol/L的Al3+可抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)生長(zhǎng)、破壞植物結(jié)瘤以及擾亂細(xì)菌的光合作用和固氮作用[3]．近年來(lái)，對(duì)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的耐鋁性能[4]研究較深入；Kanazawa等[5]從酸性土壤中分離和鑒定了一批具有耐鋁性能的酵母菌及霉菌,對(duì)Al3+有著極高的抗性；從土壤中篩選出來(lái)的菌株Acidocellaaluminiidurans也被證實(shí)有耐鋁能力[6]．目前大多數(shù)耐鋁菌株的相關(guān)研究是針對(duì)土壤中的動(dòng)、植物或真菌展開(kāi)的,關(guān)于水環(huán)境中細(xì)菌的耐鋁研究相對(duì)較少．

污水處理系統(tǒng)中通常添加鋁鹽來(lái)實(shí)現(xiàn)化學(xué)協(xié)同脫氮除磷和強(qiáng)化造粒[7].添加聚合氯化鋁(PAC)可以大幅度提高對(duì)總磷的去除率[8],同時(shí)對(duì)化學(xué)需氧量(COD)的去除效果也有所改善[9]．鋁鹽的添加可使活性污泥的沉降性能提高，活性降低，微生物種群數(shù)量減少[10]，且對(duì)亞硝化細(xì)菌和異養(yǎng)菌的呼吸速率均存在抑制作用[11]．高于60 mg/L劑量的明礬對(duì)自養(yǎng)細(xì)菌具有毒害作用,使氨氧化速率和總凱氏氮去除率顯著降低[12]．因此,篩選具有脫氮性能的耐鋁菌株,研究其在污水處理中的方法與機(jī)制具有一定的應(yīng)用前景．

本研究從湖北省武漢市黃家湖底泥中篩選出2株能耐受20 mmol/L Al3+的細(xì)菌,通過(guò)生理生化鑒定、掃描電鏡(SEM)形態(tài)觀察和16SrRNA基因序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，進(jìn)而對(duì)其在不同Al3+濃度下的脫氮特性進(jìn)行了研究,并通過(guò)X射線衍射(XRD)分析了Al元素在培養(yǎng)液中的形態(tài)分布,以期為這2株耐鋁細(xì)菌應(yīng)用于工程實(shí)踐提供技術(shù)支持,為鋁鹽應(yīng)用于化學(xué)協(xié)同脫氮除磷提供理論依據(jù)，并為其他耐鋁生物脫氮工藝提供一些參考．

1　材料與方法

1.1　菌種來(lái)源和培養(yǎng)基

菌種取自湖北省武漢市黃家湖湖泊底泥,采用XDB-15型柱狀土壤采樣器采樣．耐鋁菌株的富集培養(yǎng)采用含20 mmol/L Al3+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;分離純化采用含20 mmol/L Al3+的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;耐鋁菌株的脫氮性能檢測(cè)采用改良的反硝化培養(yǎng)基[13]，配方如下(g/L):NaAc 4.7,Na2HPO4·7H2O 7.9,KH2PO41.5,NH4Cl 0.3,MgSO4·7H2O 0.1,NaNO30.85和微量元素溶液2.0 mL．其中微量元素溶液的配方為(g/L):乙二胺四乙酸(EDTA)50,ZnSO42.2,CaCl25.5,MnCl2·4H2O 5.1,FeSO4·7H2O 5.0,CuSO4·5H2O 1.6,(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1和CoCl2·6H2O 1.6．

1.2　細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離純化

取2 mL湖泊底泥懸濁液加入到100 mL滅菌的含20 mmol/L Al3+(以Al2(SO4)3·18H2O添加)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,并調(diào)節(jié)pH值至7.2,在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)2 d(150 r/min,30 ℃)；然后將1 mL富集培養(yǎng)后的菌液接種到新的100 mL滅菌的含20 mmol/L Al3+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d,此過(guò)程重復(fù)3次．吸取100 μL擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液涂布于滅菌的含20 mmol/L Al3+的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板,將培養(yǎng)皿倒置在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；待菌落長(zhǎng)出后,挑取單菌落于滅菌的含20 mmol/L Al3+的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,直至得到純化的單菌落．

1.3　菌株生理生化鑒定和形態(tài)特征觀察

菌株生理生化特性鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]進(jìn)行,主要包括革蘭氏染色、葡萄糖發(fā)酵、淀粉水解、接觸酶和硝酸鹽還原試驗(yàn)．將分離的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)2 d 后,觀察菌落的形狀、大小、顏色以及挑起難易程度等,樣品經(jīng)預(yù)處理后通過(guò)SEM(Nova 400 Nano)觀察菌體的形態(tài)和大?。畼悠奉A(yù)處理操作如下:挑取菌落于1 mL離心管中,先用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次；然后用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液于4 ℃浸泡過(guò)夜,依次用體積分?jǐn)?shù)為50%,70%,80%,90%,95%的乙醇分別浸泡脫水20 min,震蕩混勻,保證樣品充分與乙醇接觸；最后用無(wú)水乙醇脫水2次,每次15 min；脫水后的樣本常溫干燥,經(jīng)過(guò)抽真空噴金后,在場(chǎng)發(fā)射SEM下觀察．

1.4　16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增純化和測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成,按SK8255(細(xì)菌)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA,采用2720 Thermal Cycler型PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR擴(kuò)增純化,然后用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖電泳(150 V，100 mA，20 min)進(jìn)行檢測(cè),最后采用3730XL型測(cè)序儀(Applied Biosystems)測(cè)序．DNA片段的擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物[16]:正向引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)．在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性搜索,用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行多序列匹配,采用MEGA 6軟件對(duì)鑒定的2株耐鋁菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已報(bào)道的同源菌株及其他耐鋁菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,用鄰接(N-J)法構(gòu)建并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)．

1.5　不同Al3+濃度下菌株的脫氮性能研究

設(shè)置反硝化培養(yǎng)基中Al3+濃度分別為0,5,10,15 mmol/L,pH=7.2,將1 mL菌液接種于200 mL滅菌的反硝化培養(yǎng)基中,在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d(150 r/min,30 ℃),測(cè)定培養(yǎng)液中總氮(TN)、硝酸鹽氮(NO3--N)、氨氮(NH4+-N)、亞硝酸鹽氮(NO2--N)的濃度變化.相關(guān)測(cè)定方法[17]:TN采用堿性過(guò)硫酸鉀消解法;NO3--N采用紫外分光光度法;NH4+-N采用納氏試劑光度法;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法．每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較不同Al3+濃度下菌株的脫氮能力．

1.6　培養(yǎng)液中Al元素的化學(xué)形態(tài)分析

將在10 mmol/L Al3+條件下培養(yǎng)3 d后的細(xì)菌與鋁鹽形成的絮凝體用超純水清洗3遍,烘干研磨成粉末,通過(guò)XRD(PANalytical X′Pert Pro)分析培養(yǎng)液中Al元素的化學(xué)形態(tài)．

2　結(jié)果與討論

2.1　菌落形態(tài)特征與生理生化特性

圖1　Q1(a)和Q3(b)菌株的菌落形態(tài)圖Fig.1 The colony morphology of Q1 (a) and Q3 (b) strains

圖2　Q1(a)和Q3(b)菌株的SEM圖Fig.2 SEM micrographs of Q1 (a) and Q3 (b) strains

將富集純化培養(yǎng)后的Q1和Q3菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)2 d后觀察菌落形態(tài)特征．如圖1所示：Q1形成的菌落為淡黃色,圓形,表面光滑,凝膠狀,難挑起;Q3形成的菌落為白色,圓形,邊緣不光滑,易挑起．Q1和Q3的場(chǎng)發(fā)射SEM圖像如圖2所示:Q1為短桿狀,寬1.2～1.5 μm,長(zhǎng)1.5～4.0 μm;Q3為桿狀,寬1.0～1.2 μm,長(zhǎng)2.5～5.0 μm．2株菌株的生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示．

表1　Q1和Q3菌株的生理生化特性

注：+代表陽(yáng)性,-代表陰性．

2.2　16S rRNA基因同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)篩選出的2株菌株進(jìn)行16SrRNA基因測(cè)序分析,將所得序列通過(guò)BLAST檢索與GenBank中已知的基因序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明：Q1菌株與鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp.)B2菌株(JX941542)的相似度最高,Q3菌株與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)M15菌株(LN890101)的相似度為99%．Q1和Q3菌株的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)分別為KY767658和KY767659．采用MEGA 6軟件將Q1和Q3菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的同源性菌株以及其他耐鋁菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示．

2.3　不同Al3+濃度下菌株的脫氮性能

考察不同Al3+濃度下2株菌株的脫氮性能,結(jié)果如圖4所示．

圖3　用N-J法構(gòu)建的基于16S rRNA基因序列的同源性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 N-J phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of the homological strains

圖4　Q1和Q3菌株在不同Al3+濃度下的脫氮性能Fig.4 Nitrogen removal characteristics of Q1 and Q3 strains under different Al3+concentrations

由圖4(e)～(h)可知：Q3在Al3+濃度為0,5,10,15 mmol/L條件下,對(duì)TN的去除率分別為44.11%,48.03%,30.42%和25.90%,對(duì)NH4+-N的去除率分別為89.51%,91.60%,85.43%和71.26%,較低濃度(5 mmol/L)和較高濃度(10和15 mmol/L)的Al3+相比，Q3對(duì)TN和NH4+-N的去除率均存在顯著性差異(p<0.05),表現(xiàn)為較低濃度的Al3+對(duì)TN和NH4+-N的去除有一定促進(jìn)作用,而較高濃度的Al3+則起抑制作用;Q3對(duì)NO3--N的去除幾乎不受Al3+濃度的影響,去除率均在93.03%左右,未出現(xiàn)顯著性差異(p>0.05),且均有較多的NO2--N積累,可能是由于Q3缺乏亞硝酸鹽還原酶.總體來(lái)說(shuō)，Q3的脫氮性能優(yōu)于Q1,Al3+對(duì)Q1脫氮性能的影響大于Q3,可能是由于蠟狀芽孢桿菌Q3的細(xì)胞壁較厚可以阻止部分Al3+進(jìn)入細(xì)胞．

上述結(jié)果顯示Q1和Q3菌株在不同Al3+濃度下均能實(shí)現(xiàn)對(duì)NO3--N和NH4+-N的去除,隨著Al3+濃度升高,Q1對(duì)NH4+-N的去除率升高,對(duì)NO3--N的去除率降低,Q3對(duì)NH4+-N的去除率總體呈下降趨勢(shì),而對(duì)NO3--N的去除率影響不大.2株菌株都產(chǎn)生NO2--N積累,可考慮與其他反硝化細(xì)菌組合使用于短程硝化-反硝化系統(tǒng)中．Patureau等[18]在厭氧與好氧交替的條件下從廢水中分離出的S.adnaesiva具有好氧反硝化能力,張艾曉[19]也分離出具有較好脫氮性能的Sphingobacteriumsp. CZ,在初始氮質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí),能實(shí)現(xiàn)對(duì)硝氮4.17 mg/(L·h)的去除速度,同時(shí)Sphingobacteriumsp.在多環(huán)芳烴(PAHs)及六六六(HCH)異構(gòu)體的降解方面也有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[20]．大部分蠟狀芽孢桿菌都具有還原硝酸鹽的作用：吳麗紅等[21]篩選的B.cereusFC1和FH2,能在NO3--N質(zhì)量濃度為400 mg/L 的條件下對(duì)NO3--N達(dá)到100%的去除,在偏堿性環(huán)境中生長(zhǎng)良好,最適pH值為7.2～8.2;張小玲等[22]發(fā)現(xiàn)在溫度為30 ℃時(shí),當(dāng)投菌濃度為2×104cfu/mL(cfu為菌落形成單位)時(shí),Bacillussp. H2在48 h可將反硝化培養(yǎng)基中約140 mg/L的NO2--N完全降解,對(duì)TN的降解率達(dá)到68.10%；B.cereusHS-N25菌株[23]對(duì)人工廢水中的NO3--N降解能力較好,在24 h 內(nèi)降解率達(dá)到72.18%,在降解過(guò)程中有NO2--N的積累,低于本研究中Q1與Q3菌株在無(wú)Al3+條件下的去除率.周迎芹等[24]從污泥中篩選出一株門多薩假單胞菌(P.mendocina)TN-05，能在48 h內(nèi)達(dá)到95%的NH4+-N去除率,略高于本研究中的Q1與Q3菌株.此外,本研究Q3對(duì)NO3--N的去除不受Al3+濃度的影響,約為93.03%,優(yōu)于具有耐鋁性能的噬氫菌(Hydro-genophagasp. B4)在36 h內(nèi)對(duì)NO3--N達(dá)到76.8%的去除率[13].綜上可見(jiàn)Q1和Q3菌株在處理污水方面有較好的應(yīng)用前景．

2.4　培養(yǎng)液中Al元素的化學(xué)分布形態(tài)

通過(guò)XRD分析,確定Q1和Q3菌株培養(yǎng)液中Al元素的化學(xué)形態(tài)，所得譜圖如圖5所示．結(jié)果表明Q1中Al元素存在的主要形態(tài)為CaAl2Si2O8·4H2O和(Mg,Fe,Al)3-x(AlSiO5)(OH)4-2x,Q3中Al元素存在的主要形態(tài)為Al4(SO4)(OH)10·36H2O和Al0.47Si0.15P0.38O2．

Mg和Fe元素是細(xì)胞內(nèi)輔酶的重要組成成分,Q1培養(yǎng)液中Al元素部分以(Mg,Fe,Al)3-x(AlSiO5)(OH)4-2x的形態(tài)存在,而正常情況下Al與Mg、Fe元素不易結(jié)合在一起,說(shuō)明Al元素可以取代細(xì)菌所需的微量元素;而Q3具有較厚的細(xì)胞壁可以阻止部分Al元素的入侵．由于Al與腺苷三磷酸的結(jié)合能力比Mg高107倍,Al會(huì)取代Fe使得涉及檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化的多種酶活性降低[10],從而導(dǎo)致TN、NO3--N和NH4+-N的去除率降低．

圖5　Q1(a)和Q3(b)菌株培養(yǎng)液中Al元素化學(xué)形態(tài)的XRD譜圖Fig.5 XRD diagrams of the chemical forms of aluminum in the culture media of Q1 (a) and Q3 (b) strains

3　結(jié)　論

1) 本研究中分離培養(yǎng)獲得2株具有脫氮性能的耐鋁菌株Q1和Q3．經(jīng)生理生化鑒定、SEM形態(tài)觀察和16SrRNA基因測(cè)序,確定菌株Q1為鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp.),Q3為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)．

2) 分離得到2株菌株均能在20 mmol/L Al3+濃度下生長(zhǎng),且在15 mmol/L Al3+濃度下脫氮性能良好；但2株菌株的脫氮性能受Al3+的影響有一定差異,15 mmol/L Al3+對(duì)Q1的硝氮去除作用產(chǎn)生明顯抑制而對(duì)Q3基本無(wú)影響．

3) XRD結(jié)果表明Q1中Al元素存在的主要形態(tài)為CaAl2Si2O8·4H2O和(Mg,Fe,Al)3-x(AlSiO5)(OH)4-2x,Q3中Al元素的存在的主要形態(tài)為Al4(SO4)(OH)10·36H2O和Al0.47Si0.15P0.38O2,說(shuō)明部分Al元素可能通過(guò)取代細(xì)菌所需的部分微量元素進(jìn)而影響菌株的脫氮性能．

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