鄒　禹,鄭　嬌,張　靜,劉賢德,王志勇,蔡明夷

(集美大學 水產學院,農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室,福建 廈門 361021)

1　材料與方法

1.1　實驗材料及染色體制備

1.2　染色體制片的染色

染色體制片分別用碘化丙啶(PI)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和硝酸銀染液進行染色．PI和DAPI染色參考鄭嬌等[12]的方法．硝酸銀染色(銀染)根據(jù)Howell等[13]的方法略作修改:染色體制片平放于50 ℃濕潤培養(yǎng)皿中;明膠顯影液和50%(質量分數(shù))硝酸銀溶液按1∶2(體積比)混勻后滴加到載玻片上,蓋上蓋玻片;待反應液呈金褐色時取出制片,去離子水沖洗后用5%(質量分數(shù))Na2S2O3溶液終止反應．

1.3　FISH

圖1　染色體的PI染色核型圖(a)和3D-光強度圖(b)Fig.1 Karyotype image with PI staining (a) and 3D-optical density histogram (b) of M. miiuy chromosomes

采用FISH技術定位18S rDNA、5S rDNA和端粒序列在染色體上的分布位置．其中,2種rDNA片段均利用PCR擴增獲得．DNA提取、PCR引物設計、PCR體系及程序參照鄭嬌等[12]的方法．端粒序列通過無模板擴增獲得,引物為(TTAGGG)5和(TAACCC)5[14]．上述PCR產物用缺口平移試劑盒(Roche公司)制備生物素或地高辛標記探針．探針變性、染色體制片變性、探針與染色體制片雜交、雜交后洗滌、信號放大、復染和封片等步驟參照蔡明夷等[15]的方法．

1.4　鏡檢及數(shù)據(jù)分析

染色體的顯微圖像利用熒光顯微鏡(Olympus BX53)觀察．分散良好的中期染色體用電荷耦合元件(CCD)圖像傳感器(Olympus DP80)拍攝．用IPP 6.0軟件分析染色體圖像,測量染色體的長度、寬度、面積、累積光密度(IOD)和3D-光強度[16]．綜合各項測量數(shù)據(jù)完成染色體配對,并按相對長度降序排列出核型圖，用Adobe Photoshop CC軟件輔助完成．

2　結果與分析

2.1　核型圖像分析

2.2　核型數(shù)據(jù)分析

選取5個數(shù)目完整、分散良好的中期相,測量染色體的相對長度、相對面積和PI染色的相對IOD,并計算各參數(shù)的平均值,結果見表1．其中,1號染色體的相對長度為(5.542±0.280)%,24號染色體相對長度為(2.756±0.026)%；染色體的相對長度、相對面積和相對IOD的分布均比較連續(xù),但三者的排序并不一致．

表1　染色體的相對長度、相對面積和相對IOD

%

2.3　染色體特征識別

DAPI染色結果如圖2(a)所示：染色體呈現(xiàn)熒光強度不均勻,特別是在1號染色體距離著絲粒約1/3臂長處呈現(xiàn)出明顯的暗帶．銀染結果如圖2(b)所示:每個間期核有1～2個深染的核仁組織區(qū)域(NOR);每個中期相染色體組有1對深染的NOR,位置與DAPI染色的暗帶相當．18S rDNA和5S rDNA雙色FISH結果如圖2(c)所示:18S rDNA和5S rDNA均只有1對位點,分別位于1號染色體DAPI暗帶區(qū)域和2號染色體著絲粒區(qū)域．端粒序列FISH結果如圖2(d)所示:端粒的熒光信號在所有染色體上均特異地出現(xiàn)在端部區(qū)域,未發(fā)現(xiàn)臂間端粒信號;除部分端粒信號略微弱外,總體信號強度較均勻．

(a) DAPI 染色,箭頭所指為DAPI暗帶;(b) 銀染,箭頭所指為NOR;(c) 18S rDNA和5S rDNA雙色FISH;(d) 端粒序列FISH．標尺為10 μm．圖2　染色體的中期相圖Fig.2 The metaphase image of M. miiuy chromosomes

3　討　論

3.1　染色體識別

相對于其他脊椎動物與植物而言,海水魚類染色體研究發(fā)展比較滯后．一方面是由于染色體制備需要細胞分裂旺盛的活體材料,而海水魚類取樣相對陸生動植物困難;另一方面是由于海水魚類染色體普遍有規(guī)格小、長度連續(xù)、標記匱乏等特點,且適用于哺乳動物的G帶和Q帶技術往往不能成功應用于魚類,導致海水魚類染色體識別較困難[17]．為了提高魚類染色體辨識水平,研究人員致力于開發(fā)各種技術,如復制帶、限制性內切酶顯帶、自身基因組熒光原位雜交(self-GISH)等[12,17]．

PI是DNA定量中最常用的熒光染料,對DNA染色幾乎沒有選擇性．染色體經PI染色后呈現(xiàn)熒光強度不均勻的特點,可能是DNA在染色體不同部位濃縮水平存在差異的結果[18]．本研究利用PI染色方法發(fā)現(xiàn)染色體呈現(xiàn)強度不均勻的熒光，染色體不同位置的熒光強度有一定差異,呈現(xiàn)出特定的熒光強度分布模式;同源染色體間熒光分布模式雖然略有差異,但總體小于非同源染色體之間的差異．利用IPP 6.0軟件獲得的3D-光強度圖可以更直觀地顯示熒光染色強度的二維分布,為染色體的人工識別和配對提供了豐富的信息,同時為進一步開發(fā)魚類染色體自動分析系統(tǒng)奠定了基礎．相比鄭嬌等[12]基于self-GISH和圖像分析的染色體識別方法,本方法操作更簡便．

表2　石首魚類rDNA FISH定位結果

Tab.2　Chromosomal organization of rDNA by FISH in Sciaenidae

物種18SrDNA5SrDNA對數(shù)位置a對數(shù)位置a參考文獻廈門白姑魚(Argyrosomusamoyensis)11st,PRX13rd,TER[22]棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)b11st,STL(F);1st,P(M)11st,STL(F);1st,P(M)[23]大黃魚(Larimichthyscrocea)118th,TER9～10[22]黃姑魚(Nibeaalbiflora)11st,PRX21st,TER;4th,STL[7]眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)11st,PRX23rd,STL;8th,PRX[24](M.miiuy)11st,PRX12nd,TER本研究

注：a.命名參考文獻[24]，TER表示t染色體的著絲粒端,PRX表示近著絲粒區(qū)域,P表示短臂,STL表示亞端部;b.棘頭梅童魚的雌(F)、雄(M)核型不一致．

FISH是20世紀80年代末發(fā)展起來的分子細胞遺傳學技術，利用核酸雜交與免疫放大定位目標探針在染色體上的位置,從而將染色體研究推進到分子水平[20]．rDNA是最常用作FISH探針的DNA序列之一．真核生物的rDNA包括45S rDNA和5S rDNA兩種獨立基因簇：45S rDNA重復單位包括28S rDNA、18S rDNA和5.8S rRNA序列和間隔區(qū)(ITS1和ITS2)；5S rDNA重復單位包括5S rDNA序列和間隔區(qū)[21]．45S rDNA FISH通常利用部分序列作探針(如18S rDNA),而5S rDNA FISH常用編碼序列和部分間隔區(qū)作探針．迄今,利用FISH對18S rDNA和5S rDNA位點進行過定位的石首魚類共6種，如表2所示：石首魚類18S rDNA位點分布數(shù)目相對保守,除大黃魚和雄性棘頭梅童魚外,均為單對位點,分布于1號染色體近著絲粒區(qū)域；相比之下,5S rDNA位點的分布模式在石首魚類不同種間的差異要大得多,不僅表現(xiàn)在位點數(shù)目上,也表現(xiàn)在染色體的相對位置上．導致rDNA位點位置差異的機制可能是轉座子的作用或同源染色體的不平衡交換等[25-26]．基于石首魚類的核型和18S rDNA分布模式很保守的特點,我們推測與5S rDNA相關的轉座子可能是導致其數(shù)目和位置變異的主要原因．

4　結　論

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