魏瑩，張哲文，陸亞敏，程艷菊

正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 南京　211100

重組蛋白藥物是指對某種疾病有預防和治療作用的重組蛋白質。將編碼蛋白質序列的基因合成出來，經過一系列操作轉入宿主細胞中，通過宿主細胞培養(yǎng)獲得重組蛋白藥物 (圖 1)。宿主細胞包括細菌、酵母菌、動物細胞和植物細胞。

1　長效重組蛋白藥物國內外發(fā)展現(xiàn)狀

生物技術藥物是新藥研究發(fā)展的熱點。近年來，制藥業(yè)的增長速度放慢，但以基因工程產品、抗體工程產品和細胞工程產品為代表的生物制藥產業(yè)卻在快速發(fā)展[1]。

圖1　重組蛋白藥物生產流程Fig.1　Production process of recombinant protein drugs.

生物醫(yī)藥作為 21世紀的國家戰(zhàn)略性新興產業(yè)和支柱產業(yè)，國家從多方面給予了高度的重視。從2006年以來，國家先后出臺了一系列的規(guī)劃和政策，鼓勵生物醫(yī)藥產業(yè)的創(chuàng)新和發(fā)展，《中華人民共和國國民經濟和社會發(fā)展第十三個五年規(guī)劃綱要》[2]中提出堅持戰(zhàn)略和前沿導向，促進生物醫(yī)藥及高性能醫(yī)療器械等產業(yè)發(fā)展壯大。

自1998年開始，生物制藥產業(yè)全球銷售額連續(xù)保持15%?33%的增長速度，成為發(fā)展最快的高技術產業(yè)之一。從地理分布來看，6家重組蛋白藥物研發(fā)巨頭公司 (Amgen、Biogen IDEC、Johnson＆Johnson、Eli Lily、Novo Nordisk、Roche)全部來自歐美[3]，占全球市場約 80%的比例。而所有歐美公司的銷售額占全球生物技術公司銷售額的97%。

從 1982年第一個現(xiàn)代生物技術藥物重組胰島素優(yōu)泌林 (Humulin) 在美國批準上市，重組蛋白藥物已走過30 多年的歷史，20世紀90年代以重組干擾素、重組生長激素、重組人紅細胞生成素等短效的重組蛋白藥物為主，1996 年長效化的胰島素類似物上市，開啟了重組蛋白藥物長效化時代，隨后聚乙二醇化重組干擾素 α、長效紅細胞生成素、聚乙二醇化重組粒細胞集落刺激因子、長效凝血因子等長效重組蛋白藥物相繼上市。

重組蛋白藥物的發(fā)展趨勢有以下兩個特點。

第一，哺乳動物細胞作為表達體系的比例增加。原因在于，原核表達系統(tǒng) (如大腸桿菌E. coli)，適合分子量較小、不需要翻譯后修飾的非糖基化蛋白 (如胰島素、生長激素、干擾素和白細胞介素等)；而哺乳動物細胞表達系統(tǒng)可進行復雜的翻譯后修飾 (如蛋白質折疊、糖基化和二硫鍵的形成)，表達的蛋白質與天然蛋白質更為接近，且能通過控制翻譯后修飾實現(xiàn)預期功效。

第二，長效化重組蛋白的進展較大。利用化學修飾、基因工程技術等對蛋白質藥物進行改造或修飾，解決大分子蛋白質藥物血液中半衰期短、給藥途徑單一、免疫原性和毒副反應等問題，增強藥物活性、提高藥效等，是近年來生物技術藥物發(fā)展的趨勢。長效蛋白質生物制劑技術的研究一直是大分子蛋白質藥物的研究熱點，國際上許多大公司紛紛開展蛋白質藥物長效制劑的開發(fā)研究，搶占核心技術的制高點。

國內外長效重組蛋白藥物的種類和數(shù)量眾多，療效良好。近年來上市的長效重組蛋白藥物詳見表1。以PEG (Polyethyleneglycol，聚乙二醇)化蛋白質藥物為例，1990 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 批準了治療重度免疫缺陷綜合征的 Adagen (Pegadamase)；2006 年，批準了培加帕酶Oncaspar (即PEG化天冬氨酸酶，可用于治療急性淋巴母細胞白血病)[4]；2011年，石藥集團百克生物的津優(yōu)力 (聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子) 獲批上市，成為國內第一個PEG化長效重組蛋白藥物；2014年 1月，長春高新的 PEG化重組生長激素獲批，是全球第一個長效的重組生長激素。截止2016年8月份，國外聚乙二醇化重組蛋白藥物已有10種以上上市，例如Adagen、Oncaspar、Pegasys、PegIntron、Neulasta、Somavert、Macugen、Mircera、Cimzia、Krystexxa、Sylatron、Omontys等[5]。

2　長效重組蛋白藥物的研發(fā)策略

2.1　影響蛋白質和多肽藥物長效性的主要因素

當藥物進入系統(tǒng)時，由各種酶引起的代謝，尤其是多種形式的蛋白水解酶的作用，可導致藥物降解為小分子肽或者氨基酸[6]。這類酶廣泛存在于胃、腸道[7]，其分布具有細胞組織的特異性。

非蛋白酶因素的影響來源于蛋白質物理或化學上的變化。物理變化包括聚合、沉淀；化學變化包括氨基酸殘基的修飾，主要有氧化作用、還原作用、脫酰胺反應、水解反應、β消除、二硫化物交換等幾種反應，并且蛋白質在構建中的穩(wěn)定性和免疫原性以及導致蛋白質化學結構錯誤變化的環(huán)境條件也被認為是影響蛋白質代謝穩(wěn)定性的主要因素。

較大的多肽常通過受體介導的方式來清除，有不少例子顯示，受體介導的清除可能是一種主要的清除機制。

不同的給藥途徑對于藥物的體內分布、代謝過程、生物利用度和藥理作用也具有顯著的影響[7]。

2.2　重組蛋白藥物長效化技術

2.2.1　化學修飾

化學修飾是延長蛋白質藥物半衰期的一個有效途徑。它是一種用化學的方法將蛋白質藥物與大分子親水修飾劑進行共價偶聯(lián)的方法。共價連接到大分子上能減小免疫原性，改善可溶性和生物學利用度，以及增加抗蛋白水解作用，同時也能夠延長半衰期[9]。

1) 聚乙二醇 (polyethyleneglycol，PEG) 修飾

PEG是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，PEG類修飾劑具有無毒性、溶解性良好、免疫原性低且高低不同分子量產品種類多、可選擇余地大等優(yōu)點，是FDA批準的極少數(shù)能作為體內注射用的合成聚合物之一。

經PEG共價修飾后，蛋白質藥物的多方面性能得到提高，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：1) 蛋白質經PEG修飾后，表觀分子半徑增大，表現(xiàn)為腎清除速率下降，且PEG在蛋白質表面起到屏蔽和位阻效應，使得修飾后的蛋白質酶解速率明顯降低，穩(wěn)定性提高，從而延長體內半衰期。例如，PEG 修飾的干擾素 (IFNα) 與未修飾的 IFNα相比，半衰期延長10?20倍；超氧化物歧化酶PEG修飾前半衰期為 5 min，PEG修飾后半衰期延長至4.2 h；2) PEG在蛋白質表面的屏蔽和位阻效應還能掩蓋蛋白質表面的抗原位點，降低了蛋白質的免疫原性；3) PEG為兩親性分子，還能改善蛋白質溶解性等理化性質[10]。

PEG修飾技術經歷了從隨機修飾到定點修飾的發(fā)展，從多個線性PEG修飾發(fā)展到單一分支型PEG修飾，從利用小分子量 (5 kDa) PEG進行修飾發(fā)展到利用大分子量 (40 kDa) 進行修飾。傳

統(tǒng)的 PEG 隨機修飾技術，修飾劑可以與蛋白藥物表面的多個位點的基團發(fā)生反應，修飾后產物是不同位點修飾異構體的混合物，產物組分復雜，產品質量難以控制，批間一致性也難以控制。而近幾年來，出于對工藝控制、質量控制以及藥物本身有效性、安全性的考慮，各種定點修飾技術受到各藥物研發(fā)機構的親睞，成為熱門方向。如Nulasta (Amgen) 和PEG化IFNb (Biogen Idec) 是利用末端氨基與賴氨酸 (Lys) 氨基解離常數(shù)的細微差異，在N末端定點修飾，添加了一個20 kDa的直鏈 PEG；Bayer 公司的 PEG 化重組人凝血因子Ⅷ，通過蛋白質工程引入半胱氨酸，利用巰基進行定點修飾；諾和諾德公司 (Novo Nordisk)則著重發(fā)展糖基化 PEG 修飾技術，即利用酶促反應，將PEG分子偶聯(lián)到蛋白質分子糖末端的唾液酸上(重組凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ)；而 Ambrx公司則是通過非天然氨基酸引入特異性的活性基團進行修飾[11]。2006年，申請美國專利的 PEG化粒細胞集落刺激因子 (PEG-G-CSF)[11]和 PEG化白細胞介素-10 (PEG-IL-10) 便是 N端氨基定點修飾的產物。

表1　近年來上市的長效重組蛋白藥物Table1　Approved long -acting recombinant protein drugs

2) 多聚唾液酸修飾

多聚唾液酸 (Polysialition，PSA) 是一類線性、均一的多聚α-2,8連接唾液酸的獨特碳水化合物，它主要通過典型的N-連接糖苷鍵附著在脊椎動物神經系統(tǒng)神經黏附分子上[4]。多聚唾液酸是一種比PEG更具潛力的蛋白藥物修飾材料，它是天然的多聚物，除了具有更好的生物相容性、可降解性和高度親水性，還具有抗人體免疫系統(tǒng)識別的功能。PSA在抗免疫識別能力和生物可降解性上具有明顯優(yōu)勢，降解產物是無毒性的多聚乙酰神經氨糖酸 (Colominic acid，CA)。目前已有多聚唾液酸化修飾的天冬酰胺酶、胰島素和干擾素等多種蛋白類藥物處于臨床試驗階段。

采用平均分子量27 kDa的氧化態(tài)CA修飾血漿丁酰膽堿酯酶 (rhBChE，plasma butyrylcholinesterase) 的產物rhBChE-CAO27皮下注射給小鼠，停留時間比未修飾的 rhBChE增長了 6.3倍 (從3.7 h增加至23.3 h)，清除半衰期增加了5.6倍 (從3 h增加至16.6 h)[13]。

3) 脂肪酸修飾

脂肪酸鏈與蛋白質發(fā)生?；揎椃磻?，通過在蛋白質表面暴露羧基殘基可增加蛋白質與血清白蛋白的親和力，從而增加它在血液中的循環(huán)時間，最終也可以延長蛋白質藥物的半衰期。酰基化對于分子量較小的蛋白質和多肽更有效，因為它相對更大地增加了蛋白質的疏水性。?；脑沓晒Φ剡\用到了蛋白質的構建上，如年銷售額已經超過 20億美元的利拉魯肽 (胰高血糖素樣肽-1，GLP-1) 和去氨加壓素 (DDAVP,Desmopressin)。

地特胰島素是由Novo Nordisk公司研發(fā)，于2004年在歐洲上市，批準治療2型糖尿病。地特胰島素是在人胰島素的基礎上，將B30的蘇氨酸去除，在B29位的賴氨酸增加一個十四碳脂肪酸鏈組成。其長效機制主要是，一是胰島素分子以六聚體形式存在，而14碳脂肪酸側鏈可增強胰島素六聚體的穩(wěn)定性，從而延緩吸收與擴散的速度；二是地特胰島素進入外周血液循環(huán)后，因其脂肪酸結構，98%與白蛋白可逆性結合，結合后再逐步解離才發(fā)揮作用，進一步延長地特胰島素的作用時間。

德谷胰島素 (Insulin degludec) 由Novo Nordisk公司研發(fā)，分別于2012年10月在日本上市，2013年在歐盟上市，2015年在美國上市，批準治療1、2型糖尿病。它是在人胰島素的基礎上，將 B30的蘇氨酸去除，通過一個 L-γ-谷氨酸連接子，將1個十六碳脂肪二酸連接在B29位賴氨酸上形成的。其長效機制主要是：皮下注射后，隨著制劑中苯酚的迅速彌散，德谷胰島素通過脂肪二酸側鏈自我聚集形成多六聚體，并于注射部位形成儲存庫，穩(wěn)定、持久地發(fā)揮其降糖作用；此后，鋅離子逐漸分散，多六聚體緩慢解離釋放出單體通過毛細血管進入血液循環(huán)，添加的脂肪二酸側鏈與血漿白蛋白發(fā)生可逆性結合，以發(fā)揮長效降糖作用[14]。皮下注射后，血藥濃度會輕微升高，10?12 h后達到最高血藥濃度，半衰期 (t1/2) 達到17?25 h[15]。

2.2.2　構建突變體

將蛋白分子一個位點或多個位點進行突變，以期改善蛋白穩(wěn)定性，提高親和力或活性，降低免疫原性等，是蛋白藥物設計的一個重點方向。

來得時 (Lantus) 是由大腸桿菌 K12株表達的重組人胰島素的突變體，在人胰島素A鏈第21個位點將天冬氨酸 (Asp) 突變成甘氨酸 (Gly)；在B鏈C端最后第30個位點加兩個精氨酸 (Arg)，使胰島素等電點pI由原來的pH 4.0變?yōu)閜H 6.7。這種突變結構在酸性條件下為澄清液體，一旦注射進人體可以形成緩釋的微沉淀物，可持續(xù)釋放，形成平穩(wěn)的藥物濃度曲線，趨近于正常生理胰島素的基礎分泌曲線，體內藥物濃度恒定長達24 h[16]。

2.2.3　蛋白融合

應用蛋白融合能夠構建具有雙功能的目的蛋白，這種融合蛋白是將2個或多個基因的編碼區(qū)首尾直接或通過接頭序列 (Linker)[17]連接，由同一調控序列控制構成的基因表達產物。在分子水平，這個技術具有設計簡單、靈活的特性。按主要結構域的化學本質將融合蛋白藥物分為細胞因子類、抗體類、酶類、受體類和激素類[18]。其中，半衰期較長、分子量較大的人免疫球蛋白 (Immunoglobulin，IgG) 的 Fc (Fragment crystallizable，可結晶片段) 片段融合、人血清白蛋白 (Human serum albumin，HSA)融合及其他血清蛋白如轉鐵蛋白 (Transferrin)融合可以達到延長半衰期的目的，而前兩者應用較為廣泛。

1) Fc融合蛋白

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技術將某種具有生物學活性的功能蛋白分子與 Fc 片段融合而產生的新型蛋白質，功能蛋白可以是能結合內源性受體 (或配體) 的可溶性配體 (或受體) 分子或其他需要延長半衰期的活性物質 (如細胞因子)[19]。Fc融合蛋白大大增加活性蛋白或多肽的分子量，降低腎小球的濾過率，而FcRn (Neonatal Fc receptor，新生兒Fc受體) 介導的再循環(huán)機制可以避免蛋白降解，有效延長半衰期[20]。另外，采用人源的 Fc片段可以降低融合蛋白的免疫原性[21]，防止人體自身免疫系統(tǒng)對藥物的消除作用，也對融合蛋白半衰期的延長有所幫助。通過基因工程手段對 Fc段的氨基酸序列進行突變，還可以獲得半衰期更長的突變型融合蛋白[22]。此外，根據需要還可以發(fā)揮Fc段結合FcγR產生的抗體依賴細胞介導的細胞毒性 (Antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC) 或結合補體C1q 來介導補體依賴的細胞毒性 (Complement-dependent cytotoxicity，CDC) 等生物學活性，進一步增強融合蛋白的效應器功能[19-23]，當然對于自身免疫疾病和炎癥性疾病等不需要效應器功能的藥物，需突變改造FcγR或使用IgG4的Fc。

Fc融合蛋白的發(fā)展分為兩個階段：第一階段，對于小分子肽通過表達二聚體融合蛋白實現(xiàn)延長藥物的半衰期 (例如禮來糖尿病藥物 Trulicity)；第二階段，對于分子量大于30 kDa的大分子蛋白使用二聚體 Fc和單體蛋白策略。百健艾迪的 Fc融合凝血因子Ⅷ蛋白產品 Eloctate、Fc融合凝血因子Ⅸ產品Nonacog beta pegol，利用的均是第二種表達策略，采用Syntonix公司專有的Syn-Fusion技術平臺生產。研究人員發(fā)現(xiàn)只有一個生物活性分子、但有兩個免疫球蛋白恒定區(qū)部分的單體-二聚體雜合體比同源二聚體更能有效地發(fā)揮功能和被轉運。這是因為，包含兩個或多個生物活性分子、以二聚體和更高等級的多聚體形式存在的嵌合蛋白存在兩個或多個相互鄰近的生物活性分子，在空間上會被阻礙與其靶分子或細胞相互作用。

截至2016年，歐美及中國共批準了14個Fc融合蛋白，包括中國批準的郎沐以及 EMA批準的兩款Enbrel的生物類似物，分別為三星Bioepis的 Benepali和 Sandoz公司的 Erelzi。Biogen的Amevive已于2011年撤市。2015年，13個融合蛋白的銷售額超過161億美元，適應癥涵蓋自身免疫病、眼科、貧血和糖尿病等，顯示出Fc融合蛋白強大的應用市場，而且未來具有良好的應用前景。從表達系統(tǒng)看，除Nplate為大腸桿菌表達、Tanzeum為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae外，其余均為以中國倉鼠卵巢細胞 (Chinese Hamster Ovary，CHO) 或人胚腎細胞 (HEK293) 為主的哺乳動物細胞表達，可以預見這一趨勢將繼續(xù)得到保持。

2) 人血清白蛋白融合蛋白

人血清白蛋白在血清中大量存在，且無毒性和免疫原性，這些特性使得白蛋白成為延長小分子蛋白或多肽半衰期的又一良好選擇。人血清白蛋白融合蛋白也是通過 FcRn介導的再循環(huán)機制避免蛋白降解，延長半衰期。由于白蛋白與FcRn結合位點與IgG不同，因此，白蛋白不會影響IgG的回收[24-25]，這種方式成為延長活性蛋白或多肽的一個重要手段。通過對白蛋白突變改造甚至可以獲得更長的半衰期，如K573P突變，使得白蛋白對FcRn受體親和力增加12倍，大幅延長半衰期[26]。此外，治療性蛋白可以連接白蛋白的N端或者 C端，甚至兩端均連接治療性蛋白形成雙特異性分子[27]。2014年，F(xiàn)DA批準了針對2型糖尿病降糖藥阿必魯肽 (Albiglutide) 即為GLP-1-HSA融合蛋白，半衰期可達6?8 d，為每周注射一次的長效GLP-1類似物。HSA融合可以顯著延長凝血因子的半衰期，如CSL Behring的FVIIa與白蛋白融合，半衰期可延長3?4倍；CSL Behring的FIX與白蛋白融合，半衰期延長 4?5倍[28]。有研究結果顯示人血清白蛋白融合后會出現(xiàn)一些目標蛋白產率低、易降解等共性的問題，可以通過融合蛋白的優(yōu)化設計、蛋白酶缺陷宿主的構建、融合基因多拷貝以及與分子伴侶共表達得以解決[29]。近年來上市的長效重組蛋白藥物詳見表1[30-32]。

2.2.4　糖基化

蛋白質的糖基化 (Glycosylation) 是真核生物的一種常見翻譯后修飾方式，是某些蛋白質發(fā)揮生物活性所必需的。蛋白質表面的糖鏈能夠影響蛋白質的藥物動力學作用、生物活性、穩(wěn)定性、對蛋白酶的易感性、水溶性、凝集性、免疫原性等。

用基因工程手段對 TNK組織纖維蛋白溶酶原激活劑分子進行糖基化修飾，修飾后的蛋白質具有更長的半衰期，并且在急性心梗治療中可以采用低劑量單次快速注射[33]。促紅細胞生成素(EPO) 是一種調節(jié)紅系祖細胞生長的細胞因子，含有3個N-糖鏈和1個O-糖鏈。研究表明，糖基化不影響其體外生物學活性，但可延長體內半衰期。由此，美國 Amgen 公司的科學家合成了一種新型的促紅細胞生成蛋白Aranesp (Novel erythropoiesis stimulatingprotein，NESP)，體內半衰期是EPO的3倍，從而達到了減少用藥次數(shù)的目的[34]。

3　總結

長效重組蛋白藥物具有極大臨床優(yōu)勢，是蛋白藥物開發(fā)的一大重要方向。諸多長效蛋白藥物已成功開發(fā)上市，長效蛋白藥物的研究開發(fā)也日益增長。

進一步推動國產長效重組蛋白藥物提升質量并國際化，推動并協(xié)助相關企業(yè)進入國際市場，進一步提高中國重組生物產品國際聲譽及地位意義重大且迫在眉睫。

政府需更加鼓勵并支持國內創(chuàng)新，逐步實現(xiàn)中國長效重組蛋白品種由仿制到創(chuàng)新，由低端模仿跟隨到高端仿制跟進，最終走向技術和產品引領。

綜上所述，進一步提高國產重組蛋白藥物質量水平，緊跟國外先進技術和質量標準發(fā)展，推進國內相關產品標準升級，并加大創(chuàng)新長效重組蛋白藥物的開發(fā)，是未來幾年國內該領域的發(fā)展方向。與國內技術型企業(yè)共同努力，成為相關產品標準的制定者和領跑者，逐步實現(xiàn)中國重組蛋白藥物產品質量標準與國際最高標準對接指日可待。

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