李云飛，桑娜，劉慧，于秀立，張亭亭，黃先忠

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832003）

開(kāi)花不僅是植物的生理現(xiàn)象，也是作物的重要性狀，不僅影響著農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和生物量，而且對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)也影響很大。正確的開(kāi)花時(shí)機(jī)具有適應(yīng)性，早花對(duì)縮短植物的生命周期具有重要的生理意義。編碼磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP） 的Flowering Locus T（FT）位于開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，不僅參與植物的開(kāi)花轉(zhuǎn)變的調(diào)控，而且還參與更多的植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控[1-4]。FT 基因在植物葉片中表達(dá)，其翻譯成蛋白（成花激素）后會(huì)經(jīng)韌皮部進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)街参锏捻敹朔稚M織，之后與Flowering Locus D （FD）蛋白形成復(fù)合物，促進(jìn)植物下游開(kāi)花通路中關(guān)鍵基因如APETALAL（AP1），LEAFY（LFY），SUPPERSSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）和FRUITFULL（FUL）等的表達(dá)，進(jìn)而促使植物早花[5-8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥FT同源基因AtFT可以使擬南芥的花期提前，而缺失FT基因的擬南芥突變體ft-10則會(huì)使擬南芥的花期延遲[9-10]。我們前期從陸地棉品種新陸早33 中克隆到了一個(gè)FT同源基因GhFT1基因，在野生型擬南芥中及ft-10突變體中過(guò)量表達(dá)GhFT1，轉(zhuǎn)基因植株要比野生型明顯提早開(kāi)花，并且可以挽救f(wàn)t-10極度晚開(kāi)花表型；轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中AtFT下游開(kāi)花相關(guān)基因AP1、SOC1、LFY和FUL明顯上調(diào)表達(dá)[11-12]。

為了進(jìn)一步研究FT 蛋白的分子生物學(xué)功能，許多研究者利用酵母雙雜交的方法來(lái)篩選FT 結(jié)合的蛋白[13]。近年來(lái)研究人員通過(guò)體外酵母雙雜實(shí)驗(yàn)篩選出許多能與FT 蛋白結(jié)合，并在植物體內(nèi)影響植物開(kāi)花的蛋白，其中比較重要的有FD[14]，14-3-3[15]，F(xiàn)T-INTERACTION PROTEIN 1（FTIP1）[16]和BRANCHED1（BRC1）[17]等。我們前期構(gòu)建了新陸早33 號(hào)棉花葉片和花混合組織的酵母雙雜cDNA 文庫(kù)，文庫(kù)篩選獲得了一個(gè)與GhFT1 互作的硫氧還蛋白類(lèi)似蛋白，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有WCRKC 保守氨基酸基序，命名為GhWCRKC2-5 （未發(fā)表資料）。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）是瑞典科學(xué)家于1964年在埃希氏菌屬大腸桿菌B 中首次發(fā)現(xiàn)并提取出來(lái)的，作為脫氧核糖核苷酸還原過(guò)程中的電子供體在DNA 合成過(guò)程中發(fā)揮作用，是一類(lèi)分子量較低的可溶性蛋白[18]。Trx 分子量一般在12 kDa 左右，是一種無(wú)處不在的抗氧化酶，Trx 家族基因分為典型和非典型兩大類(lèi)。典型的硫氧還蛋白包括H 亞族、F 亞族、M 亞族和TDX 亞族等，它們都有活性位點(diǎn)WCGPC。非典型的Trx 家族包括Trx-like 亞家族等，Trx-like 亞族包括WCRKC 和WCRVC 兩 類(lèi)[19]。

研究開(kāi)花時(shí)間的分子機(jī)制一直是科學(xué)家和農(nóng)作物育種家關(guān)注的焦點(diǎn)。棉花不僅是世界上最有價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物之一，而且是研究多倍體化、細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁生物合成的優(yōu)秀模型系統(tǒng)[20-22]。開(kāi)花轉(zhuǎn)變及時(shí)間的早晚對(duì)棉花霜前皮棉產(chǎn)量和纖維長(zhǎng)度尤為重要，而纖維發(fā)育一直是棉花育種研究的重中之重。棉花原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，對(duì)溫帶地區(qū)的低溫和土壤條件非常敏感。開(kāi)花提前是大多數(shù)棉花育種項(xiàng)目的一個(gè)重要目標(biāo)[23]。目前，對(duì)棉花Trx 家族Trx-like亞家族的相關(guān)研究少見(jiàn)報(bào)道。棉花中存在的非典型的Trx 具有什么樣的特點(diǎn)，其功能如何，是值得研究的問(wèn)題。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，首先克隆完整的GhWCRKC2-5基因完整閱讀框cDNA，酵母雙雜進(jìn)一步驗(yàn)證GhWCRKC2-5 與GhFT1 蛋白互作，并且利用陸地棉全基因組分析了棉花的Trx 蛋白；分析了GhWCRKC2-5基因的組織表達(dá)及在纖維不同時(shí)期的表達(dá)特征；通過(guò)擬南芥中異位過(guò)量表達(dá)及在棉花中的病毒介導(dǎo)的基因沉默 （Virus-induced gene silencing，VIGS）分析了基因在開(kāi)花調(diào)控中的功能。本研究為深入分析GhWCRKC2-5基因在棉花中的功能，探索棉花適應(yīng)環(huán)境的開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)所用新疆陸地棉品種為新陸早33。在棉花三片真葉期（種植22 d）采集了根、莖、葉片和頂端分生組織（shoot apical meristems，SAM）樣品，在棉花開(kāi)花當(dāng)天采集花樣品。在棉花開(kāi)花前3 天和開(kāi)花當(dāng)天以及開(kāi)花后第3 天、第5 天采集胚珠組織樣品，在棉花開(kāi)花后第8 天、第12 天、第15 天、第20 天、第25 天和第30 天采集纖維組織樣品。擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株和載體

酵母pGBKT7 和pGADT7 菌種購(gòu)自Clontech 公司。含pGBKT7-BD-FT 載體的AH109 菌液、含pGBKT7-BD 載體的AH109 菌液、AH109 酵母菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。pTRV1 和pTRV2 載體由德克薩斯農(nóng)工大學(xué)植物基因組學(xué)與生物技術(shù)研究所的Ping He 教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取和cDNA 的制備

采用EASYspin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒（Aidlab Biotech，Beijing，China） 提取陸地棉不同組織的總RNA，利用M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）反轉(zhuǎn)錄制備cDNA 第一鏈。

1.2.2 載體構(gòu)建

根 據(jù)CottonGen （https：//www.cottongen.org/）陸 地棉 （TM-1）Gh_A05G2534基 因ORF 序 列，結(jié) 合pGADT7 載體酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證酵母互作引物；結(jié)合pCAMBIA2300-OCS （本實(shí)驗(yàn)室保存）植物表達(dá)載體酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)基因克隆引物；結(jié)合pTRV2 載體酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)VIGS 基因克隆引物（表1）。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由北京華大基因公司合成。使用帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)引物擴(kuò)增的20 μL 的反應(yīng)體系為：模板0.2 μL，KOD Plus Buffer 2 μL，KOD dNTPs 2 μL，KOD Mg2+0.8 μL，正反向擴(kuò)增引物各0.5 μL，KOD Plus 0.4 μL，ddH2O 13.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性2 min 后94 ℃15 s，58 ℃30 s，68 ℃37 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1% （W/V）瓊脂糖凝膠上檢測(cè)并利用Promega公司凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物連接到pBluescript II KS （本實(shí)驗(yàn)室保存）載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑選白斑過(guò)夜搖菌并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 酵母雙雜交驗(yàn)證

以誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GhFT 和空質(zhì)粒pGADT7作對(duì)照，將篩選得到的文庫(kù)質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GhFT 回轉(zhuǎn)AH109 酵母菌株，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物劃線涂SD/-Leu/-Trp（DDO）二缺平板和SD/-Ade-His-Leu-Trp（QDO）四缺平板?？筛鶕?jù)生長(zhǎng)菌落的大小來(lái)判斷相互作用的強(qiáng)弱。一般認(rèn)為，菌落大的，相互作用強(qiáng)，反之則弱。

1.2.4 非典型GhTrx 基因家族和GhWCRKC2-5基因的生物信息學(xué)分析

從陸地棉（TM-1）全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定GhTrx基 因 家 族。 在 下 載 自 CottonGen （https：//www.cottongen.org/） 的TM-1 基因注釋結(jié)果中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，最高e 值設(shè)為1×10-15。所查找到的蛋白提交到PFAM （http：//pfam.xfam.org/）和NCBI 的保守功能區(qū)域 （conserved domains） 分析程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域；MegAlign 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析；ExPASy （https：//web.expasy.org/protparam/）軟件推斷編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)；MEGA5.0 軟件進(jìn)行蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用Neighbor-Joining 方法[24]；TMHMM2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH MM-2.0/） 軟件推測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）軟件預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性；SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 基因表達(dá)分析

采用qRT-PCR 對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)分析，基因特異引物是GhWCRKC2-5-qrt-F 和GhWCRKC2-5-qrt-R，內(nèi)參基因棉花UBQ7（Gene ID：107924595）的引物為UBQ7F 和UBQ7R （表1）。根據(jù)Fast SYBR Mixture （CWBIO 公司），反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性20 s 后95 ℃變性3 s，60 ℃退火/ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。使用7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 （Life Technologies） 檢測(cè)目的基因和UBQ7內(nèi)參基因的Ct 值，每種樣品進(jìn)行3 次PCR 重復(fù)，采用2-ΔCt法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)[25]。利用Microsoft Excel 2007 軟件處理數(shù)據(jù)，Origin 2017 軟件作圖。

1.2.6 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

過(guò)表達(dá)載體35S：GhWCRKC2-5重組質(zhì)粒經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，將帶有35S：GhWCRKC2-5的農(nóng)桿菌利用侵花法（Floral dipping）侵染擬南芥[26]。收獲的T0代擬南芥種子在超凈臺(tái)上消毒后均勻地點(diǎn)種在含有30 mg/L 卡那霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基上，4 ℃下春化處理3 d 后，在22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～13 d，發(fā)現(xiàn)每皿中有大量白苗，幾乎都是兩片白色的葉子，根部也沒(méi)有生長(zhǎng)；同時(shí)有少量綠苗出現(xiàn)，并且大多有3-4 片葉子，根部生長(zhǎng)良好，把這些綠苗移栽到含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（體積比為1∶1）的盆缽中，然后放置到16 h 光照、8 h 黑暗光照培養(yǎng)間里培養(yǎng)。用CTAB 法提取植株基因組DNA，進(jìn)行PCR 檢測(cè)并且提取檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的擬南芥植株的總RNA，利用qRT-PCR 檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。待植株開(kāi)花時(shí)，統(tǒng)計(jì)植株的開(kāi)花時(shí)間和開(kāi)花當(dāng)天的蓮座葉數(shù)目，觀察植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.7 棉花VIGS

在陸地棉人工氣候室（晝/ 夜溫度25 ℃/25 ℃，光/ 暗周期16 h/8 h）培養(yǎng)供試的棉花材料，13 d 后以子葉完全展平的棉花幼苗為試驗(yàn)接菌材料。以VIGS 沉默棉花CLOROPLASTOS ALTERADOS1（CLA1） 表現(xiàn)出的白化性狀作為表型對(duì)照。構(gòu)建含GhWCRKC2-5基因的VIGS 重組載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。挑取含農(nóng)桿菌GV3101 的單菌落，接種到3 mL LB 液體培養(yǎng)基（含kan 50 mg/L，Rif 25 mg/L和Gen 40 mg/L）中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)24 h，菌落檢測(cè)后，取1 mL 接入50 mL LB 液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)12 h，至菌液OD600為1.0 左右；8000 r/min 離心5 分鐘收集菌體細(xì)胞，將菌體重新懸浮于VIGS 侵染液中 （10 mmol/L MgCl2；10 mmol/L MES；200 μmol/L AS），將侵染液終濃度調(diào)至OD600為1.5 左右；于室溫下靜置3 h 以上，將pTRV1 分別與pTRV2、pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GhWCRKC2-5的重懸液均按體積比1∶1，混勻注射棉花子葉[27]。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWCRKC2-5 與GhFT1 蛋白酵母雙雜驗(yàn)證

構(gòu)建酵母雙雜交載體pGADT7-GhWCRKC2-5，挑取在SD-Trp-Leu（DDO）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的pGBKT7-BD-GhFT1+pGADT7-GhWCRKC2-5 菌落和對(duì)照pGBKT7-BD+pGADT7-GhWCRKC2-5 菌落，分別稀釋10 倍、100 倍和1000 倍，分別吸取2.5 μL 點(diǎn)在DDO 固體培養(yǎng)基和SD-Trp-Leu-His-Ade （QDO）固體培養(yǎng)基上，觀察酵母菌落生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)pGBKT7-BD-G hFT1+pGADT7-GhWCRKC2-5 和pGBKT7-BD+pGADT7-GhWCRKC2-5 在DDO 培養(yǎng)基上都正常生長(zhǎng)，而pGBKT7-BD-GhFT1+pGADT7-GhWCRKC2-5 在 QDO上正常生長(zhǎng)，pGBKT7-BD+pGADT7-GhWCRKC2-5 在QDO 上不生長(zhǎng)。同時(shí)菌斑大小、密度相對(duì)于對(duì)照pGBKT7-BD+pGADT7-GhWCRKC2-5 酵母菌落無(wú)明顯差異 （圖1）。結(jié)果表明陸地棉GhWCRKC2-5 與GhFT1 蛋白能夠發(fā)生相互作用。

圖1 酵母中GhWCRKC2-5 與GhFT1 蛋白間相互作用分析Fig.1 Analysis of the interactions between GhWCRKC2-5 and GhFT1 proteins in Yeast

2.2 GhWCRKC2-5 基因的克隆與分析

測(cè)序后分析目的基因的序列長(zhǎng)度為612 bp，包含起始密碼子ATG 和終止密碼子TGA，為完整的開(kāi)放閱讀框。BLAST 比對(duì)分析表明，該基因?yàn)镚h_A05G2534基因，編碼203 個(gè)氨基酸，與其他植物WCRKC 類(lèi)的硫氧還蛋白具有較高的相似性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GhWCRKC2-5 蛋白的跨膜螺旋數(shù)目為0，沒(méi)有明顯的跨膜區(qū)，在膜外出現(xiàn)的可能性高于在膜內(nèi)出現(xiàn)的可能性；GhWCRKC2-5 屬于親水蛋白；GhWCRKC2-5 蛋白α-螺旋 （alpha helix） 占32.51%；延伸鏈（extended strand）占22.17%；β- 轉(zhuǎn)角（beta turn） 占6.90%；無(wú)規(guī)卷曲（random coil）占38.42%。在整個(gè)GhWCRKC2-5 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)卷曲和α- 螺旋是其主要的結(jié)構(gòu)元件。

2.3 非典型GhTrxs 家族基因結(jié)構(gòu)分析

利用全基因組比對(duì)分析，從陸地棉基因組中一共比對(duì)出46 個(gè)非典型的GhTrxs 基因，包括Atypical CYS HIS rich thioredoxin （ACHT）亞族、Tetraticopeptide Domain-containing Thioredoxin （TDX）亞族、Thioredoxin 2 （Trx2）亞族、Trx-like 亞族、PDI11 亞族、NADPH-dep endent thioredoxin reductase C（NTRC）亞族和Thioredoxin superfamily protein（TSP）亞族（圖2）。

圖2 陸地棉46 個(gè)非典型GhTrxs 的進(jìn)化關(guān)系及基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Phylogenetic relationships and gene structures of the 46 atypical GhTrxs

2.4 GhWCRKC2-5 氨基酸相似性及進(jìn)化分析

用Clustal X2 軟件對(duì)GhWCRKC2-5 基因編碼的氨基酸序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他物種硫氧還蛋白基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行相似性比較。與可可（Theobroma cacao，EOY18725）、木薯（Manihot esculenta，XP_021626636）、麻瘋樹(shù)（Jatropha curcas，XP_01208 0950）、巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis，XP_021672622）、番木 瓜 （Carica papaya，XP_021897880）、核 桃（Juglans regia，XP_018828849）、蕓苔屬甘藍(lán)（Brassica oleracea var.oleracea，XP_013613223）、 擬 南 芥 （Arabidopsis thaliana，CAC05508）氨基酸序列一致性比較，相似性分 別 為 84.0% 、62.6% 、74.5% 、77.7% 、61.4% 、74.1%、60.8%和56.0%。其中GhWCRKC2-5基因編碼的氨基酸序列與同為錦葵目（Malvales）的可可相似性最高，與擬南芥的相似性最低，且各種植物都具有保守的基序WCRKC （圖3）。對(duì)亞洲棉、雷蒙德氏棉、可可、木薯等物種進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明，陸地棉與可可進(jìn)化關(guān)系最近，與擬南芥親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 植物WCRKC2-5 蛋白氨基酸序列的多重序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of amino acid sequence of plant WCRKC2-5 proteins

圖4 GhWCRKC2-5 與其他物種同源序列的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of homologous proteins of GhWCRKC2-5 with other plant species

2.5 GhWCRKC2-5 基因的表達(dá)分析

qRT-PCR 分析表明，GhWCRKC2-5 基因在根、莖、葉、花和SAM 等不同組織中均有表達(dá)，但在根和花中的表達(dá)量高于莖、葉和SAM。在纖維發(fā)育的不同時(shí)期，GhWCRKC2-5基因表達(dá)呈現(xiàn)出降低- 升高- 降低的趨勢(shì)，在開(kāi)花前3 天到花后第3 天，GhWCRKC2-5基因的表達(dá)不斷降低?；ê蟮? 天到第25 天，GhWCRKC2-5 基因的表達(dá)不斷升高，并且在花后第25 天時(shí)的纖維表達(dá)水平最高，但花后第25天到第30天，表達(dá)又開(kāi)始降低（圖7）。GhWCRKC2-5基因的表達(dá)特征暗示該基因可能在棉花開(kāi)花和纖維發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

圖5 GhWCRKC2-5 基因的組織和纖維發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)Fig.5 Expression patterns of GhWCRKC2-5 gene in different tissues and different fiber development stages of cotton

2.6 擬南芥過(guò)量表達(dá)GhWCRKC2-5 基因促進(jìn)開(kāi)花研究

經(jīng)卡那霉素篩選和PCR 鑒定，獲得了4 個(gè)獨(dú)立的T2 代轉(zhuǎn)GhWCRKC2-5基因擬南芥陽(yáng)性植株。統(tǒng)計(jì)T2 代陽(yáng)性植株的開(kāi)花時(shí)間發(fā)現(xiàn)四個(gè)株系L15、L21、L28 和L31 的平均開(kāi)花天數(shù)分別為25.1、19.2、25.9 和22.6，明顯少于非轉(zhuǎn)基因（Col-0）植株的30.0天（表2）。統(tǒng)計(jì)開(kāi)花時(shí)期蓮座葉片的數(shù)量，L15、L21、L28 和L31平均蓮座葉分別為11.3、7.8、11.9 和7.9，明顯少于Col-0 的16.7 片（表2）。檢測(cè)擬南芥花發(fā)育相關(guān)基因FT和SOC1 的表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)GhWCRKC2-5基因擬南芥中AtFT和AtSOC1 的表達(dá)量明顯高于Col-0 （圖6），說(shuō)明GhWCRKC2-5基因參與調(diào)節(jié)植物的開(kāi)花轉(zhuǎn)變。

圖6 過(guò)量表達(dá)GhWCRKC2-5 擬南芥的表型及相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.6 Phenotypic evaluation of overexpression of GhWCRKC2-5 in A.thaliana and expression analysis of the related genes

表2 T2 代不同的轉(zhuǎn)基因株系及野生型擬南芥（Col-0）的開(kāi)花時(shí)間和蓮座葉數(shù)目Tab.2 The flowering time and rosette leaf numbers in different transgenic lines and wild type （Col-0）

2.7 棉花GhWCRKC2-5 基因VIGS 表型分析

與注射pTRV1/pTRV2（TRV2：00）載體農(nóng)桿菌的對(duì)照植株相比，注射pTRV1/pTRV2-GhCLA1農(nóng)桿菌的植株11 d 左右開(kāi)始出現(xiàn)白化表型（圖7A）；半定量PCR 分析表明，與對(duì)照相比，注射含pTRV1/p TRV2-GhWCRKC2-5載體的農(nóng)桿菌的試驗(yàn)植株中GhWCRKC2-5基因的表達(dá)水平有所減弱（圖7B）；并且，注射pTRV1/pTRV2-GhWCRKC2-5載體農(nóng)桿菌的試驗(yàn)植株比注射TRV2：00 載體農(nóng)桿菌的對(duì)照植株開(kāi)花晚，植株長(zhǎng)的也相對(duì)矮一些（圖7C）。研究結(jié)果表明在棉花中降低GhWCRKC2-5基因表達(dá)，導(dǎo)致晚花表型。

圖7 棉花GhWCRKC2-5 基因VIGS 表型分析Fig.7 Phenotypes of plants inoculated with TRV2：GhWCRKC2-5

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期以新陸早33 為實(shí)驗(yàn)材料利用酵母雙雜交的方法，構(gòu)建了FT 互作蛋白的cDNA 文庫(kù)，篩選出陸地棉中一個(gè)硫氧還蛋白類(lèi)似蛋白（未發(fā)表資料）。本研究首先經(jīng)過(guò)酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，證實(shí)二者的確互作。然后克隆了該基因，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其具有完整開(kāi)放閱讀框，屬于硫氧還蛋白家族成員，命名為GhWCRKC2-5。該基因編碼蛋白屬于非典型的Trx 家族成員；進(jìn)化上與錦葵目可可中的TcWCRKC蛋白親緣關(guān)系最近。

表達(dá)分析表明，棉花GhWCRKC2-5基因在組織表達(dá)和纖維表達(dá)中存在差異。整體來(lái)看，在纖維的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)高，GhWCRKC2-5基因表達(dá)呈現(xiàn)出降低- 升高- 降低的趨勢(shì)，其中在纖維發(fā)育25天時(shí)表達(dá)最高，隨后其表達(dá)下降。其次，GhWCRKC 2-5基因在根和花中表達(dá)較高；在莖、葉和SAM 中表達(dá)較低。可見(jiàn)，GhWCRKC2-5基因可能在棉花的纖維發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。而在擬南芥中異源表達(dá)棉花GhWCRKC2-5基因發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)擬南芥提早開(kāi)花。檢測(cè)轉(zhuǎn)GhWCRKC2-5基因擬南芥AtFT和AtSOC1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)明顯高于Col-0，說(shuō)明該基因在開(kāi)花過(guò)程可能對(duì)AtFT和AtSOC1的表達(dá)情況有一定的影響。因此，GhWCRKC2-5基因可能對(duì)棉花的纖維發(fā)育和開(kāi)花過(guò)程都存在一定的影響。

VIGS 試驗(yàn)中，沉默植株比對(duì)照植株開(kāi)花時(shí)間晚。同時(shí)，GhWCRKC2-5與GhFT1 蛋白互作，過(guò)表達(dá)GhWCRKC2-5基因?qū)M南芥FT基因的表達(dá)有一定的影響，那么GhWCRKC2-5基因作用于FT 的上游還是下游，是否參與另外一條開(kāi)花通路還需要進(jìn)一步探討研究。棉花中Trx 同源基因有多少、各有什么功能、GhWCRKC2-5基因和其他Trx 基因有什么關(guān)系、在棉花中過(guò)量表達(dá)GhWCRKC2-5基因是否會(huì)促進(jìn)植株早花都是需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題。開(kāi)展棉花硫氧還蛋白的相關(guān)研究工作，對(duì)利用現(xiàn)代分子育種技術(shù)提高棉花的環(huán)境適應(yīng)性，并在此基礎(chǔ)上對(duì)提高棉花產(chǎn)量和改善纖維品質(zhì)意義重大。