蔣曦旻，張　斌，史利寧，商秀娟，張彩云，王靜瑜，胡毓安

(1.中國人民解放軍南京總醫(yī)院a.醫(yī)學信息科；b.臨床中心實驗科，南京　210002； 2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥學部，南京　210008)

近二十年來，在ICU病人和免疫抑制患者(如艾滋病、臨床惡性腫瘤、器官移植患者)中，侵襲性念珠菌病(invasive candiasis，IC)感染率逐年增高。受限于缺少特異臨床癥狀和早期實驗室診斷指標，IC死亡率高達40%～50%，臨床結局并未獲得明顯改善[1]。免疫輔助治療和預防接種被認為可能是將來改善IC臨床治療結局的有效策略[2]，尋找有效的念珠菌疫苗分子是目前的研究熱點之一。

白念珠菌烯醇化酶(enolase，Eno)由440個氨基酸組成，分子量在45～48 kD之間，是白念珠菌中含量最豐富的可溶性蛋白之一。Eno催化糖酵解過程中2- 磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸，并在糖異生過程中催化逆向反應，參與念珠菌的能量代謝。Eno定位于白念珠菌細胞壁和胞漿內，白念珠菌出現(xiàn)菌絲相生長時Eno表達顯著增多，提示Eno與侵襲性感染相關[3]。白念珠菌Eno具有強免疫原性，在IC病人體內可檢出高滴度的抗Eno- IgG抗體，并可引起細胞免疫應答[4～6]。動物實驗的研究結果表明，Eno抗體對IC可以提供保護性作用[7～10]，因此Eno被認為是一個具有研究價值的IC疫苗候選分子。

酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISPOT)具有高敏感度(可以檢出1/105細胞)和高特異度，可以在單細胞水平測定抗原特異性T淋巴細胞分泌細胞因子的功能和數(shù)量，適用于特異性T細胞應答的測定，客觀反映免疫細胞的應答規(guī)律，被廣泛應用于疫苗機制研究和疫苗效應評價。本研究采用實驗室自制的Eno基因重組抗原，通過建立ELISPOT方法檢測健康人外周血單個核細胞(PBMC)中分泌干擾素- γ(IFN- γ)，白介素- 4(IL- 4)與白介素- 17A(IL- 17A)的Eno抗原特異性T淋巴細胞頻數(shù)，分析健康受試者PBMC在其刺激下產(chǎn)生的細胞免疫應答類型，以了解Eno抗原特異性T 淋巴細胞在IC中是否具有提供細胞免疫保護作用的可能性。

1　材料與方法

1.1研究對象選取南京軍區(qū)南京總醫(yī)院生殖中心門診男性健康體檢者25例，年齡25～48歲(31.64±5.25歲)。

1.2試劑與儀器Eno重組抗原由本課題組自制，ELISPOT試劑(mabtech公司)，PVDF板(Milipore公司)，RPMI1640培養(yǎng)液、EZ- Culture無血清培養(yǎng)液和全套人ELISPOT輔助試劑盒(深圳達科為公司)，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液(上海華精生物公司)，Biosys Bioreader 4000 PRO斑點分析儀及分析軟件均為深圳市達科為生物技術有限公司提供。

1.3方法PBMC分離和分泌IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的Eno- 特異性淋巴細胞頻數(shù)檢測，按說明書和文獻進行操作[11]。無菌條件下細胞培養(yǎng)時每孔先后加入細胞懸液100 μl(濃度為2×106/ml)和刺激物10 μl。特異性抗原刺激物為Eno抗原(10 μg)，陽性對照孔的刺激物為PHA，陰性對照孔的刺激物為無血清培養(yǎng)液，試劑對照孔加EZ- Culture無血清培養(yǎng)液，不加入刺激物。每份標本設3個復孔。每次檢測同時設2個陽性對照孔、2個陰性對照孔、2個試劑對照孔，陰、陽性對照孔細胞濃度為2×105細胞/孔，檢測抗體濃度分別為：IFN- γ：1 μg/ml，IL- 4：1 μg/ml和IL- 17A：0.5 μg/ml。

1.4統(tǒng)計學分析使用SPSS 18.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。偏態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，計數(shù)資料用頻數(shù)、百分數(shù)表示。偏態(tài)分布的計量資料多組間比較用Kruscal- Wallis法，如各組間有顯著性差異，進一步采用Mann- WhitneyU檢驗進行兩組間比較，采用Bonferroni法校正P值判斷有無顯著性差異。計數(shù)資料組間比較采用Fisher’s exact test檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1Eno抗原特異性T淋巴細胞分泌IFN- γ，IL- 17A和IL- 4的陽性斑點形成細胞(SFC)ELISPOT檢測結果見圖1。Eno刺激后，分泌IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的抗原特異性T淋巴細胞頻數(shù)分別為14.00(8.5，39.00)個、0(0，0)個和2(1，4.5)個，Kruscal- Wallis法顯示三組間SFC差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=60.919，P=0)，隨后采用Mann- WhitneyU檢驗進行兩組間比較，發(fā)現(xiàn)各組間差異均有統(tǒng)計學顯著性意義(IFN- γ vs IL- 17A：U=35.5，IFN- γ vs IL- 4：U=0，IFN- γ vs IL- 4：U=41.0，均P<0.01)，見圖2。Eno刺激后產(chǎn)生強IFN- γ應答(SFC≥20)的健康人占40.00%(10/25)，無受試者產(chǎn)生強IL- 17A和IL- 4應答。

圖1　重組人Eno刺激健康人PBMC產(chǎn)生的細胞

2.2Eno抗原特異性T淋巴細胞免疫應答模式分析Eno刺激后，25例健康受試者分泌IL- 4，IL- 17A和IFN- γ的應答率分別為4%(1/25)、88%(22/25)和100%(25/25)，IFN- γ和IL- 17A應答率均高于IL- 4，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見圖3。健康受試者PBMC細胞免疫應答模式以同時產(chǎn)生Th1和Th17型應答為主，占84%(21/25)；3例研究對象僅產(chǎn)生Th1型細胞免疫應答(12.00%，3/25)，4%(1/25)同時產(chǎn)生Th1，Th2和Th17型3種細胞免疫應答，未觀察到單獨產(chǎn)生Th2型或Th17型細胞免疫應答者，見圖4。

圖2　IFN- γ，IL- 4和IL- 17A的頻數(shù)比較

圖3　IFN- γ，IL- 4和IL- 17A應答陽性率

圖4　健康人對白念珠菌Eno的細胞免疫應答類型

3　討論

白念珠菌是常見的院內血流感染病原菌[1]，目前IC不斷升高的感染率和居高不下的死亡率[12]，使得學者們不斷尋找可以改善IC治療結局的新策略，比如免疫輔助治療和預防接種。而尋找理想的念珠菌保護性疫苗分子并闡明其保護機制是IC疫苗研發(fā)領域的熱點[2]。

Eno是念珠菌能量代謝的重要酶類[5]，其表達水平和白念珠菌侵襲性生長相關[3]，被認為可能是IC的診斷標志物[5，6]，因此，Eno是IC診斷、治療和預防研究中的一個熱門分子。在IC感染過程中，白念珠菌Eno及其重組蛋白均被證實具有較強的免疫原性，可以引發(fā)人體和實驗動物產(chǎn)生強烈的體液免疫應答。如血清蛋白質組學分析顯示，IC病人血清中存在高滴度的抗Eno- IgG[5，6]，重組Eno免疫小鼠和家兔，均能產(chǎn)生高滴度的抗Eno- IgG。動物模型的研究結果顯示，Eno在念珠菌感染過程中誘導產(chǎn)生的抗體具有保護作用。重組Eno或Eno近N端14個氨基酸多肽免疫后的小鼠對致死性念珠菌血流感染具有抵抗力，其腎臟、肝臟、脾臟、腦等器官真菌載量下降，小鼠生存期延長。在對實驗小鼠實施致死劑量白念珠菌的靜脈注射前，被動轉移抗Eno- IgG抗體、抗Eno單抗或Eno免疫后動物血清，觀察到實驗小鼠臟器真菌載量明顯降低甚至完全清除，可顯著提高小鼠生存率[4，7，10]?？赡苡捎谘芯克捎玫男∈笃废?、白念珠菌感染菌株和免疫方案不同，盡管有研究認為Eno對IC的保護效果為中等，但Eno仍被認為是一個有潛力的疫苗分子。

Li等[7]發(fā)現(xiàn)Eno- IgG通過抗體介導的調理作用促進吞噬細胞清除和中性粒細胞對白念珠菌的殺傷實現(xiàn)保護作用。Montagnoli等[4]用重組Eno聯(lián)合IL- 12佐劑免疫B細胞缺陷的BALB/c b- /b- 小鼠，在這種不能產(chǎn)生抗體的小鼠品系中也觀察到了與野生型小鼠類似的保護作用，他們進一步用Eno或熱滅活的白念珠菌刺激Eno免疫后小鼠CD4+T細胞，檢測到細胞培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子IFN- γ和IL- 2分泌增多，因此他們認為Eno的保護作用是通過細胞免疫功能發(fā)揮的。這些實驗結果提示Eno對IC的保護作用機制可以通過體液免疫和細胞免疫作用單獨或共同實現(xiàn)。

在某種抗原刺激下，機體內針對該抗原的特異性T淋巴細胞克隆會發(fā)生活化和擴增，ELISPOT 技術可通過檢測活化后抗原特異性T淋巴細胞所分泌的特定細胞因子，直觀地反映T細胞的免疫反應類型，并具有較高的靈敏度及特異度，可彌補ELISA檢測血清或培養(yǎng)上清中細胞因子的含量時，易受其半衰期、代謝等因素的影響，且無法精確估算分泌細胞因子的T細胞數(shù)量的缺點。本研究證實，在健康人群中普遍存在白念珠菌Eno抗原特異性T淋巴細胞克隆，白念珠菌Eno在健康人群中可引起細胞免疫應答，細胞免疫應答類型以Th1型和Th17型為主，幾乎不引起Th2型應答。

在機體抵御白念珠菌感染中，由Th1和Th17細胞亞群介導細胞免疫發(fā)揮了重要的保護性作用[13]。Th1細胞亞群通過分泌IFN- γ，IL- 2，IL- 12和TNF- β等細胞因子，促進中性粒細胞和吞噬細胞募集和激活，發(fā)揮吞噬和清除念珠菌的活性；Th17細胞亞群可以分泌IL- 17A，通過募集中性粒細胞至感染部位和上調抗微生物多肽表達發(fā)揮抗念珠菌活性；Th2細胞亞群分泌IL- 4，IL- 5和IL- 10等細胞因子，可抑制Th1細胞和吞噬細胞活性，誘導吞噬細胞的不完全吞噬，降低對念珠菌的抵抗力；還可通過上調精氨酸酶1活性，降低具有抗真菌活性的NO水平[2，14]，此外Th2細胞應答還與病理免疫應答相關。本研究結果顯示，經(jīng)Eno刺激后，健康受試者PBMC中IFN- γ和IL- 17A的應答率和SFC頻數(shù)均顯著高于IL- 4(P均=0)，84%(21/25)的受試對象PBMC同時產(chǎn)生Th1型和Th17型細胞免疫應答，12%(3/25)的研究對象僅產(chǎn)生Th1型細胞免疫應答，1例受試者(4%，1/25)同時產(chǎn)生Th1，Th2和Th17型三種細胞免疫應答，未觀察到單獨產(chǎn)生Th2型或Th17型細胞免疫應答者。其中Eno刺激后產(chǎn)生強IFN- γ應答(SFC≥20)的健康人占40.00%(10/25)，無人產(chǎn)生強IL- 17A和IL- 4應答。說明白念珠菌Eno引起機體PBMC產(chǎn)生的細胞免疫應答以保護性的Th1型和Th17型應答為主，幾乎不引起對IC易感的Th2應答。結合以往白念珠菌Eno引發(fā)強烈的體液免疫應答研究結果，我們認為Eno暴露于機體免疫系統(tǒng)后，既可以產(chǎn)生保護性的體液免疫應答，也可以產(chǎn)生保護性的細胞免疫應答，提示Eno是一個理想的IC疫苗分子。

參考文獻：

[1]Quindos G．Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis．A changing face[J]．Rev Iberoam Micol，2014，31(1)：42- 48．

[2]Ito JI．T cell immunity and vaccines against invasive fungal diseases[J]．Immunological Investigations，2011，40(7/8)：825- 838．

[3]胡毓安，史利寧，李芳秋，等．白色念珠菌烯醇化酶免疫磁珠定量檢測方法的建立[J]．醫(yī)學研究生學報，2014，27(6)：568- 572．

Hu YA，Shi LN，Li FQ，et al．Development of an immunomagnetic bead assay for quantitative detection enolase ofCandidaalbicans[J]．J Med Postgra，2014，27(6)：568- 572．

[4]Montagnoli C，Sandini S，Bacci A，et al．Immunogenicity and protective effect of recombinant enolase ofCandidaalbicansin a murine model of systemic candidiasis[J]．Med Mycol，2004，42(4)：319- 324．

[5]Li FQ，Ma CF，Shi LN，et al．Diagnostic value of immunoglobulin G antibodies against Candida enolase and fructose- bisphosphate aldolase for candidemia[J]．BMC Infect Dis，2013，13(1)：253- 261．

[6]Pitarch A，Nombela C，Gil C．Prediction of the clinical outcome in invasive candidiasis patients based on molecular fingerprints of five anti- Candida antibodies in serum[J]．Mol Cell Proteomics，2011，10(1)：M110．

[7]Li WQ，Hu XC，Zhang X，et al．Immunisation with the glycolytic enzyme enolase confers effective protection againstCandidaalbicansinfection in mice[J]．Vaccine，2011，29(33)：5526- 5533．

[8]Xin H，Cartmell J，Bailey JJ，et al．Self- adjuvanting glycopeptide conjugate vaccine against disseminated candidiasis[J]．PLoS One，2012，7(4)：e35106．

[9]Xin H，Dziadek S，Bundle DR，et al．Synthetic glycopeptide vaccines combining beta- mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(36)：13526- 13531．

[10]Xin H，Cutler JE．Vaccine and monoclonal antibody that enhance mouse resistance to candidiasis[J]．Clin Vaccine Immunol，2011，18(10)：1656- 1667．

[11]胡毓安，王靜瑜，商秀娟，等．健康人外周血白念珠菌果糖二磷酸醛縮酶抗原特異性T細胞檢測[J]．醫(yī)學研究生學報，2017，30(6)：565- 568．

Hu YA，Wang JY，Shang XJ，et al．Detection ofCandidaalbicansfructose bisphosphate aldolase antigen- specific T cells in heathy individuals by ELISPOT assay[J]．Journal of Medical Postgraduates，2017，30(6)：565- 568．

[12]胡毓安，黃梅，王衛(wèi)萍，等．菌血癥患者血漿(1，3)- β- D- 葡聚糖結果分析[J]．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2011，26(2)，49- 52．

Hu YA，Huang M，Wang WP，et al．Plasma (1，3)- β- D- glucan concerntration in bacteremia[J]．Journal of Mondern Laboratory Medicine，2011，26(2)，49- 52．

[13]Richardson JP，Moyes DL．Adaptive immune responses toCandidaalbicansinfection[J]．Virulence，2015，6(4)：327- 337．

[14]Hernández- Santos N，Gaffen SL．Th17 cells in immunity toCandidaalbicans[J]．Cell Host & Microbe，2012，11(5)：425- 435．