王　華，蒼金榮，王　曦，劉家云，任健康，蘇寶鳳，張利俠，閆福堂，歸巧娣

(1.陜西省人民醫(yī)院，a.陜西省臨床檢驗中心；b.檢驗科，西安　710068； 2.西安市紅會醫(yī)院，西安　710054；3.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，西安　710032)

念珠菌可因生長的微環(huán)境和體內某些因素都可能引起念珠菌發(fā)生變異，使其培養(yǎng)特性、染色性、形態(tài)結構特征、生化反應、耐藥性等發(fā)生改變[1]，這些生物學性狀的改變，會給念珠菌病的實驗診斷、臨床治療帶來困擾，極易引起誤診或漏診而貽誤治療。我們將這些念珠菌變異株稱之為“念珠菌類細菌樣變異株”。對念珠菌發(fā)生變異前后生物學性狀及遺傳學特征進行了深入研究[1～5]發(fā)現(xiàn)：念珠菌極易發(fā)生類細菌樣變異，變異株無論菌落、菌體形態(tài)、核結構、生化反應、藥敏試驗均失去念珠菌固有的生物學特征而與普通細菌的生物學性狀酷似。但是其基因特征尚不清楚，為此，我們對這些念珠菌類細菌樣變異株的16S RNA序列、真菌18S RNA序列進行了分析比較。

1　材料與方法

1.1材料ATCC10231白色念珠菌標準菌株，源于陜西省疾病預防控制中心；念珠菌類細菌樣變異株是白色念珠菌標準菌株在低溫、營養(yǎng)缺乏條件或氟康唑誘導下獲得。Premix Taq PCR試劑為Takara產(chǎn)品。細菌保守基因序列16S RNA通用引物，擴增片段長度約1 400 bp，引物序列27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1429R：GGTTACCTTGTTACGACTT；真菌保守基因序列18S RNA通用引物，擴增片斷約500bp，引物序列FF：ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG，F(xiàn)R：CCGA TCCCTAGTCGGCATAG。上述PCR引物及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1念珠菌變異株的實驗室誘導和臨床分離：在低溫、營養(yǎng)缺乏條件下誘導白色念珠菌標準菌株使其變異；用不同濃度梯度的氟康唑等臨床常用抗真菌藥物誘導白色念珠菌標準菌株變異。

1.2.2真菌基因模板制備：采用煮沸法制備模板，取培養(yǎng)平板上的菌落于盛有去離子水的1.5 ml離心管中，充分懸浮菌體，置100℃沸水中煮沸10 min，10 000 r/min離心5 min后取上清液2 μl作模板進行PCR擴增。

1.2.3細菌保守基因16S RNA序列的PCR反應體系和參數(shù)：細菌保守基因16S RNA序列和真菌保守基因18S RNA序列均采用相同的反應體系和擴增條件：2×Taq PCR MasterMix(Takara公司產(chǎn)品)進行PCR，2×Taq PCR MasterMix 25 μl，模板DNA 2 μl，正向引物F(100 μmol/L) 0.2 μl，反向引物R(100 μmol/L) 0.2 μl，無菌雙蒸水22.6 μl，總體積50 μl。PCR參數(shù)：在Bio- Rad T100型PCR儀上反應的參數(shù)為：94℃預變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴增結束后取PCR產(chǎn)物10 μl在1.2 g/dl瓊脂糖凝膠上電泳，觀察并記錄結果。

1.2.4真菌保守基因18S RNA序列的擴增：采用與16S RNA反應體系和參數(shù)相同的條件進行PCR擴增，并對產(chǎn)物進行凝膠電泳分析。

1.2.5細菌保守基因16S RNA測序分析：將細菌保守基因16S RNA擴增片段送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，所得序列進行BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對分析。

2　結果

2.1念珠菌類細菌樣變異株16S RNA序列擴增陽性念珠菌類細菌樣變異株經(jīng)16S RNA引物擴增及瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細菌樣變異株16S RNA序列均擴增陽性，而白色念珠菌標準株未出現(xiàn)相應的擴增條帶(圖1)。表明念珠菌類細菌樣變異株基因組中具有16S RNA序列。

E.coli1 2 3 M 4 5Negative

E.coli：大腸埃希菌ATCC25922；M：100～6 000 bp DNA marker (100，250，500，750，1 000，2 000，4 000，5 000，6 000 bp)；1：ATCC10231白色念珠菌標準株；2：ATCC10231白色念珠菌標準菌株，斜面?zhèn)鞔? 灰白粗大G+桿菌，類似芽孢狀；3：ATCC10231白色念珠菌標準菌株，4℃?zhèn)鞔? 黃色G+桿菌；4：ATCC90029白色念珠菌標準菌株氟康唑誘導- 灰白粗大G+桿菌，類芽孢狀；5：ATCC90029白色念珠菌標準菌株氟康唑誘導- 灰白粗大G+桿菌，類芽孢狀傳代- 黃色G+桿菌。

圖1念珠菌類細菌樣變異株16S RNA基因擴增結果

2.2念珠菌類細菌樣變異株18S RNA序列擴增結果念珠菌類細菌樣變異株經(jīng)18S RNA引物擴增及瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細菌樣變異株除2號菌株有微弱的條帶外，其余變異株18S RNA序列均未擴增出目的條帶，而白色念珠菌標準株則出現(xiàn)相應的擴增條帶(圖2)。表明念珠菌類細菌樣變異株基因組中18S RNA序列所占比例不多或是因多次傳代遺失。

E.coli1 2 3 M 4 5Negative

圖2　念珠菌類細菌樣變異株18S RNA基因擴增結果

2.3念珠菌類細菌樣變異株16S RNA序列比對結果念珠菌類細菌樣變異株16S RNA擴增片段經(jīng)純化后進行DNA序列測定，BLAST進行比對分析，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細菌樣變異株序列與數(shù)據(jù)庫中細菌序列有較高的相似性，其中2，4分別為內生芽胞桿菌(Bacillus endophyticus)；3，5為假棒形桿菌屬(Pseudoclavibacter terrae)。部分菌株的BLAST比對結果見圖3。

3　討論

微生物的鑒定除傳統(tǒng)的生化反應外，還可以采用測序方法對包括16S rRNA或18S rRNA等基因進行分析比對。16S rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，約1 542 bp，存在于所有細菌的染色體基因組中。在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，不同的物種16S 序列具有一定的特異性，常用于細菌分類和進化分析[6]。18S rRNA片段相對比較長，分辨能力也較強。由于片段中含有同源性較強的保守區(qū)和變異性較大的可變區(qū)，因此利用不同的區(qū)域可以進行不同真菌的親緣關系比對。目前已用于真菌的不同分類級別的鑒定，包括目、科、屬的鑒別[6]。

圖3　部分念珠菌類細菌樣變異株16S RNA序列比對結果

隨著人口老齡化及疾病結構的改變，念珠菌已成為機會感染的常見病原菌，以往教科書未見對念珠菌類原核生物樣變異方面的記載。目前臨床常用的唑類、多烯類抗真菌藥物抗真菌機理是與真菌細胞壁的麥角固醇結合而影響其細胞壁的合成，因此，不合理的抗真菌治療及體內某些因素可能是引起念珠菌發(fā)生變異的一個重要因素，這從我們的實驗室誘導和臨床分離出念珠菌變異株的事實得到驗證[1～3]。本次實驗中念珠菌類細菌樣變異株經(jīng)18S RNA引物擴增及瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)念珠菌類細菌樣變異株除2號菌株有微弱的條帶外，其余變異株18S RNA序列均未擴增出目的條帶，而白色念珠菌標準株則出現(xiàn)相應的擴增條帶；4號菌株曾經(jīng)擴增出較強的18S RNA序列條帶，經(jīng)過數(shù)年20次傳代后再擴增未見此條帶，表明念珠菌類細菌樣變異株基因組中18S RNA序列所占比例不多或是因多次傳代遺失。電鏡觀察具有明確親緣關系的念珠菌標準菌株、念珠菌類細菌樣變異株、變異菌返祖株在核物質存在形式上確有質的改變，失去真核生物應有的特征，而與原核細胞生物學特性酷似，這種遺傳學特征的改變可能是念珠菌發(fā)生類原核生物樣變異的根源[7]。實驗[4]還證實，念珠菌和其類細菌樣變異體在條件合適時可在真核細胞與原核細胞之間互變，此研究在生物進化特別是在原核細胞與真核細胞的進化聯(lián)系上有非常重要的意義，念珠菌很可能是真核生物和原核生物間的一個過渡體。16S RNA和18S RNA序列分析表明，念珠菌類細菌樣變異株基因組含有細菌保守基因及少量真菌保守基因，證明具有原核生物學性狀的念珠菌類細菌樣變異株是源于真核生物的念珠菌。念珠菌類細菌樣變異是一個復雜且少有的研究課題，我們期待獲得更多分子生物學信息，來進一步闡明原核細胞與真核細胞的進化相互關系。

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