黃書明，吳玉蘭，江　楓，倪溫慨，管程齊，陸翠華，肖明兵

(1.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通　226006；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通　226006)

血清標(biāo)志物是提高胰腺癌的早期診斷水平最易推廣應(yīng)用的方法，但目前臨床上常用的胰腺癌診斷標(biāo)志物CEA，CA19- 9，CA50等傳統(tǒng)血清標(biāo)志物的特異度和敏感度均較低，其臨床診斷價(jià)值有限。鈣囊素(S100A11)是具有EF手型的S100鈣連接蛋白家族重要成員之一[1]，其在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)[2]，提示其對(duì)胰腺癌具有早期診斷價(jià)值[3]。本研究首次構(gòu)建納米磁珠分選聯(lián)合時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定(nanomagicbeabs sorting- time resolved fluoroimmuno assay，NMBS- TRFIA)檢測(cè)血清S100A11，同時(shí)探討其對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象為南通大學(xué)附屬醫(yī)院住院患者，其中胰腺癌88例，男性49例，女性39例，中位年齡57歲；胰腺囊腫10例，男性5例，女性5例，中位年齡50歲；急性胰腺炎50例，男性27例，女性23例，中位年齡52歲。所有病例均經(jīng)臨床和(或)病理學(xué)證實(shí)。以體檢健康者20例作為正常對(duì)照，男性11例，女性9例，中位年齡51歲。均在治療前采集清晨空腹靜脈血8 ml，分離血清后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑和儀器本研究所需試劑為：西安金磁納米生物科技有限公司提供的GoldMag○R- CS納米金磁微粒(30 nm)蛋白偶聯(lián)試劑盒，美國(guó)SantaCruz公司提供的S100A11鼠抗人單克隆抗體和S100A11羊抗人多克隆抗體及美國(guó)PE公司提供的Eu- labeled streptavidin。本研究所需儀器為：美國(guó)PE公司提供的VICTOR X5時(shí)間分辨免疫熒光器。

1.3方法采用GoldMag○R- CS納米金磁微粒(30 nm)蛋白偶聯(lián)試劑盒將經(jīng)2次偶聯(lián)液預(yù)處理的GoldMag○R- CS納米金磁微粒與偶聯(lián)抗體S100A11鼠抗人單克隆抗體37℃，180 r/min振蕩偶聯(lián)20 min；封閉液封閉后加入待測(cè)血清(或S100A11標(biāo)準(zhǔn)蛋白)37℃反應(yīng)1 h，磁性分離2 min，然后將待測(cè)血清全部取出后凍存；分離后的磁珠經(jīng)洗滌后加入生物素標(biāo)記的S100A11羊抗人多克隆抗體置37℃，1 h；磁性分離后棄去檢測(cè)抗體，洗滌后加入Eu- labeled streptavidin 37℃避光，1 h；磁性分離洗滌，加入增強(qiáng)液反應(yīng)后移于96孔檢測(cè)板，以時(shí)間分辨免疫熒光器(TRFIA)于激發(fā)波長(zhǎng)337 nm、發(fā)射波長(zhǎng)615 nm測(cè)各孔熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本S100A11濃度。

2　結(jié)果

2.1納米磁珠分選- TRFIA檢測(cè)S100A11方法的建立30 nm粒徑的超順磁性復(fù)合微粒，其核為納米磁性粒子，核表面是金的殼層，不需共價(jià)耦聯(lián)試劑，可成功將S100A11抗體耦聯(lián)在納米金磁微粒表面，耦聯(lián)有S100A11抗體的納米金磁微?？梢詮难逯蟹蛛x出S100A11。該法檢測(cè)系列稀釋S100A11標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在6.08～500 ng/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，見圖1，批內(nèi)CV≤6.35%，批間CV≤7.12%，平均回收率為104.7%。

圖1　NMBS- TRFIA法檢測(cè)S100A11的劑量- 反應(yīng)曲線

2.2各組血清S100A11水平比較胰腺癌、急性胰腺炎、胰腺囊腫S100A11水平分別為185.53±161.19，106.06±113.83，68.99±47.83 ng/ml，與正常對(duì)照組(37.98±25.14 ng/ml)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.065，-3.375，-2.266，均P<0.01)。

2.3S100A11對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值以胰腺囊腫組、急性胰腺炎組和正常對(duì)照組為參照，做S100A11的ROC曲線。ROC曲線下面積AUC=0.985(95%CI：0.972～0.997)，根據(jù)ROC曲線計(jì)算得到S100A11診斷胰腺癌的最佳界值為89.5 ng/ml(敏感度81.8%，特異度67.5%)。以S100A11濃度89.5 ng/ml為診斷界值時(shí)，胰腺癌、急性胰腺炎、胰腺囊腫患者及健康者的陽(yáng)性率分別為81.8%(72/88)，46.0%(23/50)，20.0%(2/10)，5.0%(1/20)，對(duì)胰腺癌的診斷敏感度顯著高于其它3組(P均<0.01)。見圖2。

圖2 S100A11診斷胰腺癌的ROC曲線圖

3　討論

胰腺癌是胰腺惡性腫瘤中最常見的一種，5年存活率僅3%～5%[4]，85%的患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，放化療等綜合治療對(duì)改善患者的存活效果甚微[5]。因此，尋找具有較高敏感度和特異度的胰腺癌血清標(biāo)志物對(duì)胰腺癌的早期診斷具有非常重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，S100A11與多種腫瘤的形成和進(jìn)展具有一定的相關(guān)性，如胰腺癌、胃癌、肝癌、食管癌、肺癌、大腸癌等[6～9]。

時(shí)間分辨免疫熒光是一種具有敏感度高、特異度強(qiáng)、穩(wěn)定性好的定量檢測(cè)方法[10]。納米磁珠兼具高分子粒子和磁性粒子的特性，具有固定效率高、易于磁性分離及生物相容性好等特點(diǎn)，同時(shí)大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程、縮短測(cè)試周期、明顯提高檢測(cè)敏感度[11]，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA，病毒的檢測(cè)。本研究首次構(gòu)建NMBS- TRFIA法檢測(cè)血清S100A11水平，先采用抗體耦聯(lián)的納米磁珠進(jìn)行分選，從體積較大的標(biāo)本中(如500 μl)富集篩選出目的蛋白，并重新釋放到微小體積的檢測(cè)液中(如5 μl)，使得樣本一次濃縮100倍，從而大大提高了檢測(cè)敏感度。該法的平均回收率高，批內(nèi)、批間差異小，表明該法具有較好穩(wěn)定性及重復(fù)性。因此，應(yīng)用NMBS- TRFIA法檢測(cè)血清S100A11濃度值得在臨床推廣。

針對(duì)現(xiàn)階段小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)情境教學(xué)存在的問題，教育工作者應(yīng)當(dāng)從自身與教學(xué)方法兩個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)與反思，尋求更加有效地對(duì)情境的應(yīng)用對(duì)策，提高教學(xué)的質(zhì)量。本文從三個(gè)方面具體的探究了小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)中情境教學(xué)的對(duì)策。

本研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中S100A11水平明顯高于急性胰腺炎、胰腺囊腫及正常人群。以89.5 ng/ml為診斷界值時(shí)，敏感度81.8%，特異度67.5%，胰腺癌的陽(yáng)性率也顯著高于急性胰腺炎、胰腺囊腫患者及正常人群，說明S100A11是胰腺癌的早期診斷標(biāo)志物之一，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2，12]。

綜上所述，血清S100A11診斷胰腺癌具有較高的敏感度和特異度，是一種診斷早期胰腺癌的新型血清標(biāo)志物。NMBS- TRFIA檢測(cè)方法的應(yīng)用，在初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者血清重復(fù)利用的同時(shí)，提高了檢測(cè)敏感度，為臨床的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)和TRFIA高通量檢測(cè)提供了新方法。

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