楊　坤，高　源，鄔明麗，藍(lán)賢勇，雷初朝，陳　宏，劉武軍，黨瑞華*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且易消化吸收，各種成分與人乳相近，是一種比較理想的飲用食品[1]。自古以來(lái)在新疆地區(qū)的少數(shù)民族就有飲用酸馬奶的習(xí)慣，且酸馬奶可做藥用。隨著人民生活水平的不斷提高，馬奶產(chǎn)品以其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性和保健特性正被越來(lái)越多的人們所接受。隨著馬奶的需求日益增多，發(fā)展馬乳產(chǎn)業(yè)存在很大潛力[2]。

乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lactotransferrin，LTF)也稱為乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)，是一類具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)特性的糖原，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，在各種分泌物和組織中均有表達(dá)[3]。乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以其廣譜抑菌作用著稱，常被添加在食品及飼料中抗貧血、治療乳腺疾病和增強(qiáng)免疫力。嬰兒奶粉中添加乳鐵蛋白，能改善腸道微生物菌群、促進(jìn)鐵吸收、降低脂質(zhì)氧化[4]，因其不易失活、功能穩(wěn)定的特性，也被作為動(dòng)物飼料的綠色添加劑[5]。此外，也有學(xué)者報(bào)道中國(guó)荷斯坦牛LTF基因上的SNPs與日均產(chǎn)奶量、乳脂率等產(chǎn)奶性狀顯著相關(guān)[6]。Pawlik等[7]發(fā)現(xiàn)LTF基因c.33G>A、c.-926G>A、g.109741625A>G 3個(gè)SNPs可作為波蘭荷斯坦牛泌乳性狀優(yōu)良標(biāo)記位點(diǎn)，證明其可能是家畜泌乳性能相關(guān)候選基因。目前，家馬上關(guān)于LTF的研究多集中于其免疫作用，未見泌乳性狀相關(guān)分析[8]。

伊犁馬是我國(guó)培育的以速度快、挽力好、適應(yīng)性強(qiáng)而著稱的乘挽兼用型優(yōu)良馬種[9]。中國(guó)沒(méi)有專門化乳用馬品種，目前，關(guān)于中國(guó)家馬品種泌乳性能相關(guān)基因的研究甚少，尚未見到對(duì)伊犁馬產(chǎn)奶性能育種值估計(jì)和評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道[10]。本試驗(yàn)初步研究了伊犁馬LTF基因CDS區(qū)SNP多態(tài)，并將發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)與其日均產(chǎn)奶量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩查了與泌乳性能相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，為中國(guó)乳用馬的高效選育、種質(zhì)資源保存與利用提供一定的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)用馬試驗(yàn)所用的馬匹全部來(lái)自新疆伊犁昭蘇馬場(chǎng)，放牧、飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件相同，年齡(約為5～6歲)、胎次(3～4胎)及產(chǎn)駒時(shí)間相近的伊犁馬成年母馬共224匹，其中有產(chǎn)奶記錄的73匹。

1.1.2主要試劑瓊脂糖、丙烯酰胺、血液基因組DNA提取試劑盒、核酸染料、DL50 Marker、DL2000 Marker、Mixture、雙蒸水、TBE緩沖液等。

1.1.3引物設(shè)計(jì)合成根據(jù)NCBI上家馬LTF基因序列(NC_009159)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增馬LTF基因CDS區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)域(表1)。引物使用NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)，送上海生工生物工程有限公司合成。

表1　引物序列、擴(kuò)增區(qū)域、片段長(zhǎng)度及退火溫度Table 1　The primer sequence, amplified region, fragment size and annealing temperature

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1血樣采集及指標(biāo)測(cè)定對(duì)73匹伊犁馬分別進(jìn)行頸靜脈采血，5～8 mL/只，加入枸緣酸鈉抗凝，-80 ℃保存?zhèn)溆?，并記錄統(tǒng)計(jì)其120 d產(chǎn)奶量。

1.2.2基因組DNA的提取采用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。從所采集樣品中選取個(gè)體差異較大的個(gè)體構(gòu)建DNA池[11]。

1.2.3DNA池PCR擴(kuò)增利用構(gòu)建的DNA池進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為為25 μL：DNA模板4 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水6.5 μL。

PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4直接測(cè)序及BLAST檢測(cè)選取特異性好、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。利用DNASTAR 7.1軟件中的SeqMan程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正和BLAST分析確定SNPs。

1.2.5PCR-RFLP分析根據(jù)發(fā)現(xiàn)的LTF基因SNP位點(diǎn)，使用WatCut限制性內(nèi)切酶在線工具網(wǎng)站(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)分析并選擇合適的限制性內(nèi)切酶，使用NCBI在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)酶切引物，擴(kuò)增伊犁馬LTF相關(guān)基因SNP位點(diǎn)。

PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，包括：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 6.25 μL，雙蒸水4.75 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s：60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存.

獲得的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系為5 μL PCR產(chǎn)物、9 μL ddH2O、2 μL buffer緩沖液、3 μL限制性內(nèi)切酶，混勻后37 ℃消化過(guò)夜，1%瓊脂糖凝膠或10%聚丙烯酰胺膠電泳檢測(cè)酶切片段，凝膠成像系統(tǒng)觀察并用Excel記錄分型結(jié)果。

1.3　數(shù)據(jù)處理分析

1.3.1伊犁馬產(chǎn)奶數(shù)據(jù)采集根據(jù)伊犁馬生理特點(diǎn)，分別在一天的12、14、16、18時(shí)擠奶，稱量并記錄120 d內(nèi)每匹伊犁馬的產(chǎn)奶量。用薩伊金公式計(jì)算母馬日均產(chǎn)奶量，方法如下：

W=G×24/h(W：一晝夜產(chǎn)奶量；G：12 h擠出的全部奶量；h：擠奶時(shí)間總和)

泌乳期短于120 d的校正到120 d，超過(guò)120 d的截止至120 d的產(chǎn)奶量，校正公式如下：

120 d校正產(chǎn)奶量=實(shí)際產(chǎn)奶量×實(shí)際產(chǎn)奶天數(shù)對(duì)應(yīng)的校正系數(shù)

使用Excel對(duì)產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。

1.3.2伊犁馬LTF基因多態(tài)與日均產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析使用SPSS 19.0軟件對(duì)伊犁馬日均產(chǎn)奶量與SNP多態(tài)性進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，分析LTF基因多態(tài)性與伊犁馬日均產(chǎn)奶量的相關(guān)性。

2　結(jié)果與分析

2.1　PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

部分1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果見圖1。從圖1以看出，特征性擴(kuò)增良好，片段整齊、單一無(wú)拖尾，目的片段長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果相符，可直接用于后續(xù)分析。

2.2　PCR產(chǎn)物序列分析

選取擴(kuò)增較好的DNA池PCR產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNA Star軟件中的Meg Align和Seq Man程序進(jìn)行組裝、拼接。比較發(fā)現(xiàn)，在伊犁馬LTF基因第二外顯子中檢測(cè)到一個(gè)SNP位點(diǎn)：c.173 G>A。DNA池測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖1　部分LTF基因引物PCR擴(kuò)增結(jié)果M. Marker DL2000;1-4. PCR產(chǎn)物；a. Exon 2;b. Exon 3Fig.1　The partial electrophoretogram for PCR of LTF geneM. Marker DL2000;1-4. PCR product;a. Exon 2;b. Exon 3

2.3　伊犁馬LTF的PCR-RFLP分析結(jié)果及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，使用PCR-RFLP法對(duì)224匹伊犁馬樣品的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，選用XmnⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分型結(jié)果如圖3所示。根據(jù)酶切結(jié)果統(tǒng)計(jì)樣本基因型，對(duì)LTF基因多態(tài)位點(diǎn)的雜合度

圖2　DNA池測(cè)序結(jié)果Fig.2　The results of DNA pool sequencing

(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)進(jìn)行分析，進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。根據(jù)Botstein多態(tài)信息含量分類標(biāo)準(zhǔn)，PIC>0.5為高度多態(tài)性位點(diǎn)，0.5>PIC>0.25為中度多態(tài)性位點(diǎn)，PIC<0.25為低度多態(tài)性位點(diǎn)。由表可見，所檢測(cè)的位點(diǎn)屬于中度多態(tài)，且不滿足哈代-溫伯格平衡。LTF基因的優(yōu)勢(shì)等位基因型為GA，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，多態(tài)信息含量為0.37。

2.4　伊犁馬泌乳相關(guān)基因多態(tài)性與日均產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析

選擇胎次和年齡相近的73匹伊犁馬母馬，記錄統(tǒng)計(jì)其日均產(chǎn)奶量及該SNP位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)。使用IBM SPSS Statistics 19將其泌乳數(shù)據(jù)與該位點(diǎn)的基因型進(jìn)行單因素方差分析，分析結(jié)果見表3。從表3中可見，該位點(diǎn)與伊犁馬日均產(chǎn)奶量之間不存在顯著相關(guān)。

圖3　伊犁馬LTF基因PCR-RFLP分型電泳圖Fig.3　 The electrophoretogram for PCR of Yili equine LTF geneM. Marker DL2000

注：df=2，χ20.05(2)=5.99，χ20.01(2)=9.21，PIC>0.5為高度多態(tài)，0.25

Note：df=2，χ20.05(2)=5.99，χ20.01(2)=9.21，PIC>0.5 for highly polymorphic，0.25

3　討　論

本研究分析了伊犁馬品種LTF基因的外顯子及啟動(dòng)子序列，并將發(fā)現(xiàn)的多態(tài)與伊犁馬日均產(chǎn)奶量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。在伊犁馬LTF基因中檢測(cè)到1個(gè)SNPs : c.173 G>A，該位點(diǎn)可致LTF蛋白第58位氨基酸由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。使用PCR-RFLP方法對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行分型并進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，該位點(diǎn)在伊犁馬群體中為中度多態(tài)且不處于哈代-溫伯格平衡。與其日均產(chǎn)奶量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)不同基因型的日均產(chǎn)奶量差異不顯著，但各基因型的產(chǎn)奶量GG>GA>AA。

表3　伊犁馬LTF基因不同基因型與日均產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)分析Table 3　Correlation analysis of different genotype and daily milk yield of LTF gene in Yili equine

注：P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

Note：P<0.05 is significant difference，P<0.01 is extremely significant difference.

LTF具有廣譜抑菌作用，與動(dòng)物的免疫功能息息相關(guān)，也有學(xué)者報(bào)道LTF基因可能是家畜泌乳性能相關(guān)候選基因，但對(duì)該基因的報(bào)道仍然較少，因此該基因在群體中可能尚處于選育狀態(tài)，受到選育的力度較大而處于不平衡狀態(tài)。

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果分析判斷，c.173 G>A位點(diǎn)位于LTF基因CDs區(qū)上，是錯(cuò)義突變，但表型差異仍然不顯著，可能因?yàn)榘l(fā)生突變的氨基酸并不在蛋白質(zhì)的活性區(qū)域上。此外，由于滿足年齡、胎次相近的馬匹樣本數(shù)量較少，泌乳性能數(shù)據(jù)僅有日均產(chǎn)奶量一項(xiàng)，關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果與實(shí)際可能存在差異。如果能得到更多性狀的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可使結(jié)果更加可靠。

泌乳性狀作為一個(gè)數(shù)量性狀，它的表現(xiàn)不僅受基因的影響，還有環(huán)境的作用。產(chǎn)奶量是一個(gè)遺傳力極低的性狀，常規(guī)選育并不能使其大幅度提高，分子遺傳學(xué)的發(fā)展使標(biāo)記輔助選擇(MAS)更加便捷，而科研人員需要做的就是找到影響產(chǎn)奶量性狀的候選基因。目前，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)了大量存在于外顯子和內(nèi)含子中的變異，而這些突變也為MAS提供了參考，但關(guān)于馬泌乳性能的有效標(biāo)記還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。因此我們下一步的工作便是尋找影響馬產(chǎn)奶量的有效候選基因，為中國(guó)乳用馬的高效選育、種質(zhì)資源保存與利用提供了一定的依據(jù)。

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