湯友苗 王興玲 婁華 喬玉蓮 杜明澤

【摘要】 目的：比較不同來源精子應用于卵胞漿內單精子顯微注射（ICSI）治療的胚胎發(fā)育及早期臨床結局。方法：回顧性分析2014年1月-2016年6月因男性因素在鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心行ICSI治療的1 732個新鮮移植周期。根據精子來源分為：A組射精組（n=1 253），B組經皮附睪精子抽吸（PESA）組（n=418），C組經皮睪丸精子取精（TESA）組（n=61）。比較三組正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質胚胎率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率、活產率及早產率。結果：C組的正常受精率、正常卵裂率均低于A組和B組（P<0.05），B組優(yōu)質胚胎率高于A組和C組（P<0.05），B組臨床妊娠率高于A組（P<0.05），三組異位妊娠率、流產率、活產率及早產率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：PESA和TESA均可以用于梗阻性無精子癥患者的助孕，但就早期胚胎質量和臨床妊娠率綜合考慮，經皮附睪取精行卵胞漿內單精子顯微注射術更優(yōu)。

【關鍵詞】 卵胞漿內單精子顯微注射； 精子來源； 經皮附睪精子抽吸術； 經皮睪丸精子取精術；妊娠結局

【Abstract】 Objective：To compare the embryonic development and early clinical outcomes of intracytoplasmic sperm injection（ICSI） with sperm from different sources.Method：The date of 1 732 cases received ICSI from January 2014 to June 2016 in Reproductive Medicine Center of the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University was analyzed retrospectively.According to the source of sperm，all cases were divided into group A（ejaculation group，n=1 253），group B[percutaneous epididymal sperm aspiration（PESA），n=418]，group C[testicular sperm extraction（TESA），n=61].The embryonic development and pregnancy outcomes among three groups were compared.Result：The rate of normal fertilization and cleavage in group C were significantly lower than those in group A and group B（P<0.05）.Group B had more good-quality embryo than those of group A and group C（P<0.05）.The clinical pregnancy rate in group B was higher than that in group A（P<0.05）.There were no significant differences in ectopic pregnancy rate，abortion rate，live birth rate and premature delivery rate among three groups（P>0.05）.Conclusion：PESA and TESA can be used in patients with obstructive azoospermia.However，considering the early embryonic quality and clinical pregnancy rate，PESA-ICSI is better.

【Key words】 Intracytoplasmic sperm injection； Sperm source； Percutaneous epididymal sperm aspiration； Testicular sperm extraction； Pregnancy outcome

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.006

近年來，不孕不育發(fā)病率大幅上升，有資料顯示全球不孕不育夫婦比例占15%，其中男性因素約占50%[1]。自Palermo等[2]首次用卵胞漿內單精子顯微注射術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）使體外受精（in-vitro fertilisation，IVF）或者透明帶下人工授精（subzonal insemination，SUZI）不能妊娠的女性成功生育后，該技術便受到國內外學者的關注和研究。ICSI技術是借助顯微操作系統(tǒng)將單個精子直接注射入卵母細胞質內使其受精，它對精子數量和質量的要求大大降低，這對重度少弱精以及因梗阻性無精子癥需要睪丸或者附睪取精的男性不育癥患者具有重大意義。目前應用于ICSI治療的精子來源主要有三種：一種是射出精子，另外兩種是經皮附睪精子抽吸術（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）和經皮睪丸精子取精術（testicular sperm extraction，TESA）獲得的精子[3]。不同來源的精子在結構、成熟度、活動力等方面均存在差異，而這種差異是否會影響早期胚胎質量和妊娠結局，國內外文獻結果不一，值得進一步研究。本研究回顧性分析因男性因素在鄭州大學第三附屬醫(yī)院進行ICSI治療的臨床病例，旨在比較不同精子來源應用于ICSI治療的胚胎發(fā)育情況及早期臨床結局，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年1月-2016年6月因男性因素在鄭大三附院行ICSI治療的1 732個新鮮移植周期。根據精子來源分為射精組（A組）、PESA組（B組）及TESA組（C組）。男方為單純性的重度少弱精子癥（精子濃度<5×106/mL和/或b+c級<30%，a級為0）患者入選為A組，共1 253個周期；男方為梗阻性無精子癥（至少三次精液常規(guī)檢查并離心沉淀鏡檢未發(fā)現精子，睪丸或附睪穿刺證實有精子）患者入選為B組，共418個周期；經PESA未獲得精子的梗阻性無精子癥患者入選為C組，共61個周期。納入標準：（1）男女雙方染色體均正常；（2）女方年齡<40歲；（3）不孕年限≤15年；（4）女方基礎卵泡刺激素（FSH）<10 mIU/mL；（5）女方體重指數（body mass index，BMI）介于18～25 kg/m2。排除標準：（1）女方患子宮內膜異位、子宮畸形、子宮多發(fā)性息肉及全身性疾?。ㄈ绺哐獕?、糖尿?。?；（2）獲卵總數<3個；（3）免疫性不孕；（4）數據資料不完整者。該研究已經倫理學委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵與取卵 根據患者個人情況采用本中心常規(guī)長方案/短方案/微刺激方案進行促排卵，當有2個以上優(yōu)勢卵泡直徑≥18～20 mm時，皮下注射重組人絨促性素注射液250 μg，36～40 h后在陰道超聲引導下行陰道后穹隆穿刺取卵術，取卵2 h后用透明質酸酶進行脫顆粒處理，然后置于G1培養(yǎng)液中備用，選取成熟卵子（MⅡ期）待行ICSI注射。

1.2.2 精子獲取與處理 A組患者取精前禁欲3～7 d，取卵當天采用手淫方式留取精液標本，然后采用Puresperm密度梯度離心法處理精液，選擇活動精子行ICSI。B組患者取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾后選擇穿刺點，將2%利多卡因注射在陰囊部精索內，阻滯麻醉精索神經。注射器連接頭皮靜脈針，術者左手將附睪固定于陰囊皮下，將針頭直接經皮刺入附睪頭，助手持注射器抽吸附睪液，抽出淡黃色渾濁附睪液，于倒置顯微鏡下觀察有無活動精子，如果有則采用密度梯度離心法處理標本，如果無則行對側附睪抽吸。結束后稍壓迫穿刺點至無出血，無菌敷料覆蓋。C組患者體位、消毒、麻醉同B組，術者左手固定睪丸，選擇無血管區(qū)域，持注射器直接經皮刺入睪丸（有落空感）進行睪丸穿刺，將取得的標本放于倒置顯微鏡下觀察有無活動精子，若有吹打混勻后采用直接離心法處理標本。結束后稍壓迫穿刺點至無出血，無菌敷料覆蓋。

1.2.3 受精、胚胎發(fā)育及妊娠評估 ICSI 16～18 h后觀察卵母細胞的受精情況，觀察到雌雄兩原核（2PN，pronucleus）者為正常受精，第2、3天觀察胚胎卵裂情況，根據卵裂球的數目、均一性、胞漿及碎片比例進行評分，第3天根據患者情況和胚胎質量進行移植，移植后給予常規(guī)黃體支持。移植后14 d進行尿hCG和血β-hCG檢測，移植后35 d進行超聲檢查可見妊娠囊及原始心管搏動定義為臨床妊娠，受精卵在子宮腔外著床定義為異位妊娠，妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000 g而終止者定義為流產，妊娠滿28周至不足37周（196～258 d）間分娩者定義為早產。

1.3 觀察指標 分析三組正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質胚胎率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率、活產率、早產率。2PN受精率=2PN卵子數/ICSI患者的成熟卵子數×100%，2PN卵裂率=2PN卵裂數/2PN卵子數×100%，優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數/2PN卵裂數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠數/移植周期數×100%，異位妊娠率=異位妊娠數/臨床妊娠數×100%，流產率=流產數/臨床妊娠數×100%，活產率=有活產嬰兒出生的分娩次數/移植周期數×100%，早產率=早產數/臨床妊娠數×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用單因素方差分析；計數資料以率（%）表示，比較采用行×列 字2檢驗。檢驗水準為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 三組女方年齡、男方年齡、女方BMI、不孕年限、基礎FSH、基礎雌二醇（E2）、基礎促黃體生成素（LH）、移植日內膜厚度、獲卵總數及成熟卵子數比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 三組胚胎發(fā)育情況比較 C組2PN受精率和2PN卵裂率均低于A組與B組，B組優(yōu)質胚胎率高于A組和C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 三組妊娠結局比較 B組臨床妊娠率高于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；三組異位妊娠率、流產率、活產率、早產率比較，差異均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表3。

3 討論

近年來，由于受社會與生活環(huán)境、家庭與工作壓力、不良生活習慣等諸多因素的綜合影響，男性生育力呈現逐年下降的趨勢，男性不育已成為嚴重影響社會安全、家庭質量的公共健康問題。重度少弱精及梗阻性無精子癥是男性不育病因中的兩種，對于梗阻性無精子癥的治療可以通過外科手術獲得自然妊娠，也可以通過PESA或TESA結合ICSI獲得自己的后代。本文主要探討通過PESA、TESA取精結合ICSI和重度少弱精行ICSI所產生的早期胚胎發(fā)育及妊娠結局。

對于不同來源精子行ICSI的胚胎發(fā)育情況來說，文獻[4-6]指出ICSI中使用不同來源精子可獲得相似的受精率，卵裂率和優(yōu)質胚胎率。本研究結果顯示三組2PN受精率，2PN卵裂率及優(yōu)質胚胎率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這與國內外一些學者的結果相似[7-10]。本研究中C組2PN受精率和卵裂率均顯著低于A組與B組，B組優(yōu)質胚胎率高于A組和C組，得出睪丸精子與射出精子和附睪精子行ICSI相比，受精能力降低，胚胎質量較差。正常情況下，精子在睪丸精曲小管形成后，生理上還不成熟，不能活動或活動能力很弱，無受精能力，只有經過附睪，在附睪內（14 d左右）從周圍吸收各種物質，發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的變化，從而完成成熟過程，具備受精能力；Huang等[11]研究指出睪丸精子與射出精子相比，成熟度降低，濃度和活力下降，畸形率升高，染色體異常的比例也增加，這些原因可能導致睪丸精子受精率低、胚胎質量下降。

對于不同來源精子行ICSI的早期臨床妊娠結局來說，本研究結果顯示PESA組臨床妊娠率高于射精組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這與于洪君等[9]結果相似，董瑞娜等[8]對3 106個不同來源精子ICSI周期進行分析，也得出PESA組臨床妊娠率顯著高于射出組。早前就有研究顯示對于同一個體來說，射出精子可能缺少細胞的營養(yǎng)支持，加劇氧化應激對精子細胞成分的影響，導致它的DNA斷裂相應增加，妊娠率明顯降低[11]，國外文獻[12-14]也報道精子在通過男性生殖道時可能會受到損傷，就DNA的完整性而言精子質量會降低。本研究中射精組為重度少弱精患者，此類患者受精過程多因基因、內分泌、免疫等因素而引起異常，從而導致精子數量、形態(tài)、活動能力和功能的異常；相比而言，PESA組患者不孕原因多為輸精管梗阻，自身生精功能無明顯異常，這方面也可能是導致PESA組患者妊娠率高于射出組的原因。本研究結果還顯示，三組異位妊娠率、流產率、活產率及早產率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），這與大多數學者研究結果一致[8-9，15-16]，認為妊娠后胎兒發(fā)育情況與精子的來源關系不大。

綜上所述，重度少弱精及PESA、TESA取精結合ICSI均可以用于男性不育患者的助孕手段，就早期胚胎發(fā)育和臨床妊娠率綜合方面考慮，經皮附睪精子抽吸術行ICSI可能結果更令人滿意。但ICSI技術人為地將精子注射入卵母細胞內，可能存在表觀遺傳學的改變，這就增加了子代安全性的風險。所以臨床上行ICSI治療的患者均應該進行染色體檢查，遺傳學評估，以提高子代安全性。此外由于本研究樣本量小，局限于胚胎早期發(fā)育和臨床妊娠方面，缺少對后期結局和子代安全性的觀察，所以仍需要大樣本、長期隨訪。

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