孫賢久 秦先鋒 郭少卿 劉思純 左海軍 張莉

【摘要】 目的：探討內(nèi)鏡下構(gòu)建胃食管抗反流動物模型的可行性。方法：選取6～12月齡胃食管反流病的Beagle實驗犬模型12只，分別在內(nèi)鏡下構(gòu)建抗反流動物模型，另選10只正常犬作為對照，比較各組犬食管壓力、食管pH和食管病理學檢查情況。結(jié)果：12只胃食管反流病實驗犬構(gòu)建抗反流動物模型中，10例構(gòu)建成功，1例構(gòu)建失敗，1例由于吻合口瘺死亡，成功率為83.3%；反流犬食管壓力明顯低于正常犬和抗反流犬，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.457、4.316，P<0.05），而抗反流犬與正常犬食管壓力比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.691，P>0.05）；反流犬、抗反流犬和正常犬反流>5 min次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），反流犬的反流次數(shù)和反流最長時間均明顯高于正常犬和抗反流犬（t=5.094、5.515，P<0.05；t=4.028、4.846，P<0.05），而抗反流犬和正常犬相比差異均無統(tǒng)計學意義（t=1.361、1.845，P>0.05）；反流犬和抗反流犬的反流率均明顯高于正常犬（t=8.416、4.337，P<0.05），反流犬的反流率也明顯高于抗反流犬（t=5.217，P<0.05）；正常實驗犬食管組織呈現(xiàn)明顯的復層鱗狀結(jié)構(gòu)，上皮層內(nèi)有少量炎癥細胞存在，其他各層均正常；胃食管反流實驗犬食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況；胃食管抗反流實驗犬食管組織中上皮層有輕微膨脹或增厚，黏膜層有較多炎癥細胞存在，未發(fā)現(xiàn)基層斷裂現(xiàn)象。結(jié)論：采用本研究方法構(gòu)建的抗反流動物抗反流效果顯著，可用于抗反流動物構(gòu)建的相關(guān)實驗研究。

【關(guān)鍵詞】 內(nèi)鏡； 胃食管反流； 抗反流

【Abstract】 Objective：To explore the feasibility of structuring gastroesophageal anti-reflux animal model with endoscope.Method：Twelve 6-12-month-old Beagle experiment dogs which have gastroesophageal reflux are separately structured gastroesophageal reflux animal model with endoscope.Ten more normal dogs were selected as comparison which includes esophageal pressure，esophagus pH and histopathological observation of esophagus.Result：In 12 dogs with gastroesophageal reflux，10 dogs were successfully structured and 1 dog was failed，1 dog died of anastomotic fistula，the success rate was 83.3%.The esophageal pressure of reflux dogs was significantly lower than those of normal dogs and anti reflux dogs，the differences were statistically significant（t=4.457，4.316，P<0.05），while the esophageal pressure of anti reflux dogs and normal dogs had no significant difference（t=0.691，P>0.05）.There was no significant difference in the times of reflux more than 5 min among three dogs（P>0.05）.Reflux times and the longest time of reflux of reflux dogs were significantly higher than those of normal dogs and anti reflux dogs （t=5.094，5.515，P<0.05；t=4.028，4.846，P<0.05），while anti reflux dogs and normal dogs had no statistical difference（t=1.361，1.845，P>0.05）.The reflux rate of anti reflux dogs and anti reflux dogs were significantly higher than those of normal dogs（t=8.416，4.337，P<0.05），the reflux rate of reflux dogs was significantly higher than that of anti reflux dogs（t=5.217，P<0.05）.The esophageal tissue of normal experiment dog showed a significant layer of squamous structure.Small amount of inflammatory cells existed in the epithelium.Other layers showed normal.The middle and up dermic layer of experiment dogs appeared significant expansion and thickening.Plenty of inflammatory cells existed in mucosal layer.In addition，partial muscular layers showed rupture and so on.The middle and up dermic layer of anti-reflux dogs esophageal tissue had a slight expansion or thickening.There were more inflammatory cells and no grassroots fracture was found.Conclusion：The anti-reflux effect of anti-reflux animal model structure which adopts present research method is remarkable. It can be applied into relevant experiment and study of anti-reflux animal model structure.

【Key words】 Endoscopy； Gastroesophageal reflux； Anti-reflux

First-authors address：Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University，Dongguan 523110，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.005

胃食管反流（Gastroesophageal reflux disease，GERD）主要是指由于各種因素造成十二指腸或胃的內(nèi)容物返回到食管中進而引發(fā)的并發(fā)癥或癥狀[1]。臨床上GERD患者中輕者會表現(xiàn)出惡心、發(fā)酸、胃灼熱等癥狀，重者甚至會發(fā)生出血、糜爛和食管狹窄等癥狀，會嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。從目前來看GERD的臨床治療方法有許多，雖然常規(guī)的藥物治療和外科治療具有一定的效果，但也存在其較為明顯的缺陷，近年來我國微創(chuàng)技術(shù)得到了長足的發(fā)展，由于微創(chuàng)技術(shù)在臨床治療中表現(xiàn)出的明顯優(yōu)勢，使其在各科室得到了廣泛應用[3]。目前關(guān)于GERD的內(nèi)鏡治療是近年來國內(nèi)外的研究熱點，但其安全性及療效仍需大量的動物實驗或臨床實驗證實。而制備合適的胃食管反流并動物模型對于實驗研究的準確性至關(guān)重要[4-5]。目前關(guān)于胃食管反流的內(nèi)鏡治療是近年來國內(nèi)外的一個研究熱點[6]，但其安全性及療效仍需大量的動物實驗或臨床實驗證實，而制備合適的動物實驗模型對于研究的準確性至關(guān)重要[7]。筆者另一篇研究中有報道關(guān)于胃食管反流動物模型的構(gòu)建方法，本研究中提出了一種內(nèi)鏡下構(gòu)建胃食管抗反流動物模型的方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取6～12月齡胃食管反流病的Beagle實驗犬模型12只，其中雌犬和雄犬各6只，體質(zhì)量10～12 kg，另選10只正常犬作為對照，正常犬與實驗犬性別、體質(zhì)量等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。試劑儀器：速眠新Ⅱ號，福爾馬林溶液，0.5%～1%伊紅酒精溶液，蘇木精染液，1%鹽酸酒精分化液，腎上腺素，靛胭脂，多導腸胃功能測定儀，pH動態(tài)檢測記錄儀，光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 胃食管反流病動物模型的構(gòu)建 （1）術(shù)前準備：實驗犬在術(shù)前禁食禁水1 d，以0.1～0.15 mg/kg的速眠新Ⅱ號對實驗犬進行靜脈全麻，無須進行氣管插管，使所有實驗犬可以進行自主呼吸，若實驗犬在麻醉后仍然存在躁動等狀態(tài)，應適當增加麻醉藥的使用劑量。在內(nèi)鏡下測量門齒到賁門之間的距離，在胃和食管交界處的上端7～10 cm處切開黏膜層，并在右后壁黏膜處注射腎上腺素和靛胭脂，采用Hook刀將黏膜層切開1～3 cm的開口，暴露黏膜的下層組織，并進行相關(guān)的分離操作。（2）食管黏膜下隧道的建立：食管黏膜下隧道建立的核心原則是與食管環(huán)形肌層保持垂直的角度，確保黏膜隧道始終處于直線型。（3）切開環(huán)形肌：在胃鏡下采用Hook刀在GEJ上端7～9 cm處切入，從上到下垂直切至GEJ下段1～3 cm處，暴露縱行肌，再采用Hook刀從環(huán)形肌和縱行肌的空隙中伸入，切入環(huán)形肌，在胃鏡的引導下，逐步將整個環(huán)形肌切開。

1.2.2 胃食管抗反流動物模型的構(gòu)建 首先在胃鏡下固定胃竇體前壁和腹壁，在“三角形”范圍內(nèi)取兩個點，采用穿刺針刺入到實驗犬胃腔內(nèi)，將針芯取出，將內(nèi)鏡通過鞘管插入，然后在內(nèi)鏡引導下將針持送入胃腔，并進一步將縫線和縫針送到賁門和胃底的交界之處[8]。“U”型反轉(zhuǎn)胃鏡，并在其引導下采用組織鉆鉆入到胃底和賁門交界之處的黏膜，然后向后拉黏膜，使其形成黏膜瓣，長度以5cm左右為宜，最后采用縫針和縫線將黏膜瓣進行內(nèi)縫合并結(jié)扎，使其形成向胃腔內(nèi)突起的黏膜嵴，對側(cè)采用相同的方法也制成黏膜嵴。手術(shù)結(jié)束后實驗犬食管有一定程度的延長，賁門環(huán)則會緊縮，胃食管的交界處會有抗反流瓣形成，同時食管胃底的成角會明顯加大，從而共同形成了抗反流屏障[9-10]。通過摸索，最適合的技術(shù)指標如下：抗反流瓣長度約2 cm，高度約1.5 cm，抗反流瓣形成后胃食管交界處的開放直徑約為1.0 cm[11-14]。

1.3 觀察指標

1.3.1 食管壓力測定 采用多導腸胃功能測定儀分別測定正常犬、胃食管反流實驗犬和抗反流實驗犬的食管壓力。具體測定方法如下：采用多導胃腸功能測定儀，使用高分辨四道毛細灌注測壓系統(tǒng)，以犬胃內(nèi)正常的壓力作為基準線，測定其食管壓力。

1.3.2 食管pH測定 采用pH動態(tài)檢測記錄儀分別檢測正常犬、胃食管反流實驗犬和抗反流實驗犬的食管pH值。采集食管酸反流（pH值<4）次數(shù)，長時間酸反流（pH值<4持續(xù)5 min以上）次數(shù)，最長反流時間（pH值<4持續(xù)的最長時間）以及酸反流率等指標。

1.3.3 病理學檢查 取實驗犬食管組織，采用福爾馬林固定，再用石蠟進行包埋，將包裹后的組織切片（厚度約4 μm），在60～70 ℃烘箱中干燥2 h，然后經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察其食管組織變化情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Epidata 3.0對本研究數(shù)據(jù)進行錄入校對，SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗反流動物構(gòu)建情況 12只胃食管反流病實驗犬構(gòu)建抗反流動物模型中，10例構(gòu)建成功，1例構(gòu)建失敗，1例由于吻合口瘺死亡，成功率為83.3%。在成功建模的10只反流犬的基礎上建立抗反流犬。

2.2 食管壓力情況 反流犬食管壓力為

（1.32±0.19）kPa，明顯低于正常犬的（2.33±0.35）kPa和抗反流犬的（2.13±0.24） kPa，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.457、4.316，P<0.05），而抗反流犬與正常犬食管壓力比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.691，P>0.05）。

2.3 食管pH情況 反流犬、抗反流犬和正常犬反流>5 min次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），反流犬的反流次數(shù)和反流最長時間均明顯高于正常犬和抗反流犬（t=5.094、5.515，P<0.05；t=4.028、4.846，P<0.05），而抗反流犬和正常犬相比差異無統(tǒng)計學意義（t=1.361、1.845，P>0.05）；反流犬和抗反流犬的反流率均明顯高于正常犬（t=8.416、4.337，P<0.05），反流犬的反流率也明顯高于抗反流犬（t=5.217，P<0.05）。見表1。

2.4 病理學檢查情況 正常實驗犬食管組織呈現(xiàn)明顯的復層鱗狀結(jié)構(gòu)，上皮層內(nèi)有少量炎癥細胞存在，其他各層均正常；胃食管反流實驗犬食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況；胃食管抗反流實驗犬食管組織中上皮層有輕微膨脹或增厚，黏膜層有較多炎癥細胞存在，未發(fā)現(xiàn)基層斷裂現(xiàn)象。

3 討論

近年來，雖然我國人民生活水平得到了顯著改善，但是不規(guī)律的飲食習慣導致各類消化道疾病發(fā)生率大幅升高[15]，而胃食管反流病是一種常見的消化道疾病，目前臨床上雖然有許多治療方法，主要可以分為內(nèi)科治療（藥物治療）和外科治療，但是內(nèi)科治療通常無法根治，患者需要長期服藥，且易復發(fā)因此臨床上多用于輕度胃食管反流患者的治療；外科治療雖然效果顯著，但是對患者創(chuàng)傷較大，易引起各類手術(shù)并發(fā)癥，導致手術(shù)預后效果較差。鑒于內(nèi)科治療和外科治療對于胃食管反流病的治療效果欠佳，近年來開始有國外學者研究將微創(chuàng)技術(shù)應用于胃食管反流病的治療中，其相比內(nèi)科治療和外科治療等方法具有顯著的優(yōu)勢[16]，但其安全性及療效仍需大量的動物實驗或臨床實驗證實，而制備合適的動物實驗模型對于研究的準確性至關(guān)重要。筆者在另一篇研究報道中提到目前制備胃食管反流病動物模型的方法可以分為兩類，即手術(shù)法和非手術(shù)法，其中手術(shù)法又可分為破壞食管下括約肌法、十二指腸或幽門結(jié)扎法、空腸或十二指腸吻合術(shù)法[17]。空腸或十二指腸吻合術(shù)法由于完全改變了實驗動物的消化道解剖結(jié)構(gòu)，因此通常不能用于療效評價試驗，因此應用相對較少；十二指腸或幽門結(jié)扎法制備的食管反流病動物模型通常存活期較短，多用于短期動物實驗研究，但無法滿足中長期動物實驗研究需求[18]；破壞食管下括約肌法雖然對實驗動物的造成的創(chuàng)傷較大，實驗動物具有較高的死亡率，但是其建模成功率較高，是目前應用最廣泛的制備胃食管反流病動物模型的方法。非手術(shù)方法主要是指通過食管關(guān)注胃蛋白酶或酸制備簡單的食管反流模型，但該法制備的食管反流模型通常僅適用于食管黏膜的損害、防御機制研究[19]。對此，筆者提出了一種內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開術(shù)制備胃食管反流病動物模型的方法，從研究結(jié)果來看12只行內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開術(shù)的實驗犬，無死亡，全部存活，其中8只術(shù)后出現(xiàn)反流，另外4只術(shù)后未出現(xiàn)反流，建模成功率為66.7%。制備前實驗犬食管壓力明顯大于制備后，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.112，P<0.05）。制備后的實驗犬反流次數(shù)、反流最長時間和反流率均大于制備前，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.968、4.037、4.006，P<0.05），但反流>5 min的次數(shù)制備前與制備后比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.651，P>0.05）。從病理學檢查情況來看，制備前的正常實驗犬食管組織呈現(xiàn)明顯的復層鱗狀結(jié)構(gòu)，上皮層內(nèi)有少量炎癥細胞存在，其他各層均正常。而制備后的實驗犬的食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況。這表明內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開術(shù)是一種簡單可靠的制備胃食管反流病動物模型的方法，該法制備胃食管反流病動物模型具有成功率高，不影響實驗動物解剖結(jié)構(gòu)，與胃食管反流發(fā)病機制吻合等特點，可用于評價胃食管反流的內(nèi)鏡治療或手術(shù)治療的療效觀察。

基于上述胃食管反流動物模型的構(gòu)建研究，本文中提出了一種內(nèi)鏡下構(gòu)建抗反流動物模型的方法，即通過“隧道式”消化內(nèi)鏡構(gòu)建抗反流屏障。為了探討該方法的可行性筆者選取了6～12月齡胃食管反流病的Beagle實驗犬模型12只，分別在內(nèi)鏡下構(gòu)建抗反流動物模型，另選10只正常犬作為對照，結(jié)果表明12只胃食管反流病實驗犬構(gòu)建抗反流動物模型中，10例構(gòu)建成功，1例構(gòu)建失敗，1例由于吻合口瘺死亡，成功率為83.3%；胃食管反流犬食管壓力明顯低于正常犬和抗反流犬，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.457、4.316，P<0.05），而抗反流犬與正常犬食管壓力比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.691，P>0.05）；胃食管反流犬、抗反流犬和正常犬反流>5 min次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），反流犬的反流次數(shù)和反流最長時間均明顯高于正常犬和抗反流犬（t=5.094、5.515，P<0.05；t=4.028、4.846，P<0.05），而抗反流犬和正常犬相比差異無統(tǒng)計學意義（t=1.361、1.845，P>0.05）；反流犬和抗反流犬的反流率均明顯高于正常犬（t=8.416、4.337，P<0.05），反流犬的反流率也明顯高于抗反流犬（t=5.217，P<0.05）；正常實驗犬食管組織呈現(xiàn)明顯的復層鱗狀結(jié)構(gòu)，上皮層內(nèi)有少量炎癥細胞存在，其他各層均正常；胃食管反流實驗犬食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況；胃食管抗反流實驗犬食管組織中上皮層有輕微膨脹或增厚，黏膜層有較多炎癥細胞存在，未發(fā)現(xiàn)基層斷裂現(xiàn)象。

綜上所述，采用本研究方法構(gòu)建的抗反流動物抗反流效果顯著，對于臨床上探討有效治療胃食管反流病的方法至關(guān)重要。

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