馬 馨, 張 勝, 朱屹然, 馬盼盼, 楊樹(shù)寶, 欒維民, 李子義

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春130118 ;2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院, 吉林 長(zhǎng)春130062)

“多莉”的誕生不僅打破了生命科學(xué)中動(dòng)物已分化細(xì)胞不具有發(fā)育全能性的傳統(tǒng)概念,而且由此誕生的體細(xì)胞核移植(SCNT)技術(shù)也展示出了巨大的應(yīng)用前景,它為家畜良種選育、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)、瀕危動(dòng)物保護(hù)、細(xì)胞衰老分化機(jī)理等研究提供了新的技術(shù)手段。 迄今為止,應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)已相繼誕生牛、小鼠、豬、兔等10 余種克隆動(dòng)物。 但是,目前SCNT 技術(shù)成功率仍然很低,絕大多數(shù)克隆胚胎的胎盤都會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異常,如胎盤增生、胎盤血管缺陷、臍帶畸形等[1],并由此引發(fā)胎兒各器官出現(xiàn)發(fā)育缺陷。 因此,胎盤發(fā)育異常是造成克隆胚胎妊娠失敗的主要原因之一。

基因組印記是雙親基因組的一種差異表觀修飾機(jī)制,通過(guò)印記位點(diǎn)被差異甲基化區(qū)域(DMRs)標(biāo)記,使父系或母系的等位基因出現(xiàn)單等位表達(dá),其對(duì)于胎盤的發(fā)育,胎兒的生長(zhǎng)具有重要調(diào)控作用[2]。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在克隆牛[3]、豬[4]、羊[5]等動(dòng)物胎盤中,多個(gè)印記基因mRNA 表達(dá)及DNA 甲基化水

平出現(xiàn)異常。 克隆動(dòng)物中,一些與胎盤生長(zhǎng)相關(guān)的印記基因如H19、Peg3、Cdkn1 c 都出現(xiàn)了差異甲基化區(qū)域(DMRs)的異常甲基化狀態(tài)。 克隆胚胎印記基因甲基化異常很可能是造成克隆動(dòng)物胎盤發(fā)育異常的重要原因。 因此,本研究以1 例出生后3 h死亡的克隆牛胎盤為研究對(duì)象,運(yùn)用組織學(xué)方法對(duì)該克隆牛主要內(nèi)臟器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并利用亞硫酸氫鹽測(cè)序分析胎盤中印記基因H19、Peg-10 及Snrpn 的甲基化狀態(tài),以期為提高體細(xì)胞核移植效率提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 克隆牛 本研究所選克隆牛取自吉林大學(xué)牛場(chǎng)。

1.2 主要內(nèi)臟器官的組織取材、固定及石蠟切片制備(H. E. 染色) 取死亡克隆牛心、肝、脾、肺和腎組織,修整后放入10%甲醛中浸漬固定,常規(guī)石蠟包埋切片,H. E. 染色。

1.3 胎盤組織的亞硫酸氫鹽測(cè)序分析(BSP)

1.3.1 基因組DNA 的提取及亞硫酸氫鹽處理 利用動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒(TianGen)提取基因組DNA,每個(gè)樣品取50 ng 左右基因組DNA,用甲基化試劑盒(ZYMO)進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理,并用于PCR 反應(yīng)。

1.3.2 H19、Snrpn 及Peg-10 差異甲基化區(qū)域(DMRs)的甲基化PCR 擴(kuò)增 根據(jù)牛H19、Snrpn 及Peg-10 DMRs 序列,設(shè)計(jì)甲基化PCR 引物(表1)。

表1 牛H19、Snrpn 及Peg-10 甲基化PCR 引物序列

PCR 反應(yīng)體系為25 μL,包括0.125 μL Taq DNA 聚合酶(Ex Taq, TaKaRa),2 μL DNTP,上下游引物各1 μL,1 μL 亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA,剩余體積用水補(bǔ)平。 擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性4 min,變性后加Ex Taq DNA 聚合酶,94 ℃30 s,52 ℃40 s,72 ℃30 s,共45 個(gè)循環(huán);72 ℃7 min;4 ℃保存。 DNA 回收試劑盒(TianGen)回收目的片段,將回收的DNA 用于BSP 研究。

1.3.3 BSP 測(cè)序 膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體(TaKaRa)連接2 h,轉(zhuǎn)化涂板后每個(gè)膠回收產(chǎn)物挑取15 個(gè)陽(yáng)性單克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 死亡克隆牛主要內(nèi)臟器官形態(tài)學(xué)觀察 該克隆牛出生時(shí)便表現(xiàn)出明顯異常,母牛妊娠時(shí)腹部過(guò)大,生產(chǎn)時(shí)羊水過(guò)多,胎盤增生明顯并伴有充血,子宮阜的數(shù)量比正常受精胚胎顯著減少。 出生后,無(wú)法站立,生后3 h 死亡。 剖檢主要表現(xiàn)為：心臟和肝臟體積偏大,肝臟形態(tài)顏色較為正常,但局部呈現(xiàn)黃色,肺膨脹不全并有較多脂肪覆蓋,脾臟呈灰白色且被膜增厚,兩側(cè)腎臟大小及形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。 對(duì)該克隆牛主要內(nèi)臟器官制作組織切片并進(jìn)行組織學(xué)觀察,結(jié)果表明,克隆牛心肌纖維拉長(zhǎng)變細(xì)排列欠規(guī)則,橫紋不明顯,部分核著色深呈固縮狀態(tài)(見(jiàn)中插彩版圖1A);肝臟,各肝小葉間界限不清晰,部分肝細(xì)胞索紊亂、斷裂,肝細(xì)胞胞漿出現(xiàn)較多蛋白顆粒,并有大小不等的空泡,肝細(xì)胞核亦發(fā)生固縮,肝血竇增大,血竇中及被膜下有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)中插彩版圖1B);脾臟被膜增厚,被膜向?qū)嵸|(zhì)延伸形成小梁,小梁結(jié)構(gòu)明顯,由致密結(jié)締組織組成并含有平滑肌,實(shí)質(zhì)中紅髓與白髓分界不清晰,未見(jiàn)明顯脾小體,實(shí)質(zhì)中紅髓與白髓分界不清晰,紅髓中脾索脾竇均不明顯(見(jiàn)中插彩版圖1 C);肺臟的各級(jí)毛細(xì)血管均發(fā)生擴(kuò)張充血,部分肺泡腔可見(jiàn)紅細(xì)胞,肺泡壁發(fā)生斷裂,肺泡隔增厚,肺泡上皮細(xì)胞變?yōu)榱⒎叫?見(jiàn)中插彩版圖1D);光鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常,腎小體清晰可見(jiàn)(見(jiàn)中插彩版圖1E)。

2.2 轉(zhuǎn)基因克隆牛胎盤印記基因H19、Snrpn 及Peg-10 DMRs 甲基化分析 以亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA 為模板擴(kuò)增H19、Snrpn 及Peg-10 的差異甲基化區(qū)域(DMRs),回收目的條帶,連接T 載體,并利用T 載體多克隆位點(diǎn)兩端引物做菌液PCR篩選大小正確的克隆,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,利用BiQ analyzer 分析序列甲基化水平。 克隆牛胎盤印記基因H19、Snrpn 及Peg-10 甲基化水平如圖2,轉(zhuǎn)基因克隆牛胎盤印記基因H19 及Peg-10 的甲基化水平分別為84.6%和88.6%,顯著高于50%,出現(xiàn)超甲基化狀態(tài)。 印記基因Snrpn 的甲基化水平為67.8%,也出現(xiàn)升高趨勢(shì)。

圖2 胎盤中印記基因H19、Snrpn 及Peg-10 DMRs甲基化水平分析

3 討論

胎盤發(fā)育異常是克隆動(dòng)物流產(chǎn)、死亡及克隆效率低的主要原因[6],研究報(bào)道,印記基因?qū)τ谂咛ゼ疤ケP的發(fā)育非常重要。 因此,為確定印記基因表觀修飾與克隆胚胎過(guò)度生長(zhǎng)及胎盤異常發(fā)育之間的聯(lián)系,本研究利用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法,對(duì)一例出生后3 h 死亡的轉(zhuǎn)基因克隆牛的主要內(nèi)臟器官組織形態(tài)及胎盤印記基因H19、Peg10 及Snrpn DMRs 的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析。 結(jié)果表明,出生后死亡的克隆牛主要內(nèi)臟器官均不同程度出現(xiàn)病理變化,胎盤H19 及Peg10 甲基化水平顯著升高,Snrpn 的甲基化水平與正常胎盤相比雖有升高,但差異不顯著。

出生后死亡的克隆牛胎盤中H19 及Peg-10 DMRs 出現(xiàn)了迷亂的超甲基化狀態(tài),這種超甲基化,可能引起基因表達(dá)抑制,使其表達(dá)量降低。 Su 等對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆牛的胎盤印跡基因的甲基化模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)H19 的差異甲基化區(qū)域出現(xiàn)高度甲基化[7]。 Wei 等報(bào)道產(chǎn)后死亡克隆豬胎盤的Igf2 的DMR2 以及H19 的DMRs 出現(xiàn)超甲基化[4]。 Peg-10是母源印記基因,由Ono R 等2001 年首次報(bào)道[8],該基因主要在成年動(dòng)物腦、腎臟、肺臟中表達(dá),并且在胚胎組織及胎盤中高度表達(dá)[9]。 該基因參與調(diào)控胎盤形成以及滋養(yǎng)層分化,并且在細(xì)胞增殖分化凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10-11]。 Liu 等從流產(chǎn)的4個(gè)克隆牛胚胎中檢測(cè)了Peg3 、Peg10 等印記基因甲基化的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Peg3 、Peg10 等基因都出現(xiàn)了不同程度的甲基化異?，F(xiàn)象[12],這些結(jié)果與本研究的結(jié)果相吻合,本研究結(jié)果也顯示母系印記基因Peg-10 甲基化水平顯著升高。 印記基因甲基化模式的改變與胎兒及胎盤的發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)[13]。印記基因通過(guò)調(diào)控胎盤的生長(zhǎng)進(jìn)而影響母體和胎兒之間的物質(zhì)交換最終影響胎兒的生長(zhǎng)。

本研究觀察到克隆牛心肌纖維拉長(zhǎng)變細(xì),橫紋不明顯。 肝小葉界限不清晰,部分肝細(xì)胞索紊亂,血竇中及被膜下有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 肺臟的病理變化最為明顯,其各級(jí)毛細(xì)血管均發(fā)生擴(kuò)張充血,部分肺泡腔可見(jiàn)紅細(xì)胞,壁發(fā)生斷裂,這與袁蘇婭[14]等對(duì)克隆牛肺臟的病理組織學(xué)分析結(jié)果一致。本研究中光鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常,而袁蘇婭等觀察到了腎臟的病理變化。 這種差異的原因可能是,腎臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常或印記異常的胚胎細(xì)胞隨機(jī)分化為滋養(yǎng)層,而未參與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形成,因此,雖然胎盤發(fā)育異常并伴有相關(guān)基因的印記異常,但是胚體腎臟的發(fā)育并未受到顯著影響,這也是少數(shù)克隆動(dòng)物能夠成功誕生并健康成長(zhǎng)的原因[15]。

總之,在出生后3 h 死亡的克隆牛胎盤中,我們觀察到了父源印記基因H19 及母源印記基因Peg-10 DMRs 的超甲基化。 印記基因表達(dá)異常導(dǎo)致胎盤發(fā)育異常,進(jìn)而影響克隆牛胎兒發(fā)育。 因此,推測(cè)SCNT 過(guò)程影響了供核細(xì)胞的表觀重編程,導(dǎo)致了H19 及Peg-10 迷亂的DNA 甲基化狀態(tài),最終引起胎兒及胎盤發(fā)育異常,同時(shí)也讓我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到了印記基因正確表觀重編程在胚胎發(fā)育過(guò)程中的重要作用。