張穎欣, 陳友涵, 李樹梅, 程 佳, 韓 博, 高 健

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 北京 海淀100193 ;2.北京實驗動物研究中心, 北京 朝陽100012)

近年來,環(huán)境型致病菌引起的奶牛乳房炎比例 逐漸升高[1]。 肺炎克雷伯菌作為常見的環(huán)境型致病菌,引發(fā)的乳房炎癥狀尤為嚴(yán)重,具有發(fā)病急、死淘率高、奶量下降嚴(yán)重、抗生素治療效果不佳等特點[2-4],給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素在奶牛場的廣泛使用,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)的菌株不斷出現(xiàn)。 ESBLs 是一類由質(zhì)粒介導(dǎo),能水解氧亞氨基β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶,對碳青霉烯類和頭霉素抗生素敏感,其活性可被克拉維酸、舒巴坦所抑制。 ESBLs 家族數(shù)量龐大,最常見的三種基因型為blaTEM、blaSHV和blaCTX-M[5]。 相較于其他革蘭陰性菌,肺炎克雷伯菌在環(huán)境中存活時間更長;因此,更易產(chǎn)生攜帶ESBLs 基因的菌株,并且不斷進(jìn)化[6]。 產(chǎn)ESBLs 型克雷伯菌往往具有多重耐藥的特點,并能夠?qū)⒛退幮匝杆俚剞D(zhuǎn)移。 因此,必須對其進(jìn)行監(jiān)控,并制定相應(yīng)的防控策略。

目前,已經(jīng)有產(chǎn)ESBLs 型大腸桿菌在我國奶牛場流行情況的相關(guān)報道[7-8]。 作為同樣重要的環(huán)境型致病菌,產(chǎn)ESBLs 的肺炎克雷伯菌在全國范圍內(nèi)規(guī)?；鲋械牧餍袪顩r還不得而知。 據(jù)悉,僅有一篇區(qū)域性報道[9],涉及的牛場數(shù)和樣本量較少。因此,本試驗旨在全國范圍內(nèi)調(diào)查產(chǎn)ESBLs 型菌株在奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌中流行情況;并對其基因亞型進(jìn)行鑒定,為綜合防控肺炎克雷伯菌性乳房炎提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 2015 年至2016 年間,于全國77 個大型規(guī)?；膛鲋蟹蛛x鑒定了124 株臨床乳房炎源性肺炎克雷伯菌,這些奶牛場分布于河北、河南、黑龍江、內(nèi)蒙古、北京、天津、甘肅、江蘇、安徽、上海、陜西、遼寧、山東等13 個省份。 質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922,購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司;肺炎克雷伯菌ATCC700603,購自溫州康泰生物科技有限公司。

1.2 試劑 LB 肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂;購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Mueller-Hinton 瓊脂(MHA);購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司;頭孢噻肟30 μg、頭孢噻肟/克拉維酸30/10 μg、頭孢他啶30 μg、頭孢他啶/克拉維酸30/10 μg 藥敏紙片;購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒;購自北京華泰博奧生物科技有限公司;2 ×Taq supermix;購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DL-2 000 DNA Marker;購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 ESBL 表型確證 根據(jù)CLSI 推薦的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作：無菌生理鹽水調(diào)節(jié)待測菌液至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?將菌液均勻地涂布在MHA 平板,貼頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸的藥敏紙片,每個紙片至少相隔24 mm,于37 ℃培養(yǎng)16 ～18 h。 若兩組中任何一組藥物,在加克拉維酸后與其對應(yīng)不加克拉維酸的抑菌圈相比,增加值≥5 mm,被判定為產(chǎn)ESBLs 菌株[9]。 質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603(陽性對照株)和大腸埃希菌ATCC25922(陰性對照株)。

1.4 ESBLs 基因型檢測 使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(北京華泰博奧生物科技有限公司)提取DNA,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。 參照MA 等[10]合成ESBLs 編碼基因引物,由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min,隨后95 ℃變性1 min,51 ℃退火1 min(blaSHV型退火溫度為55 ℃,blaCTX-M型退火溫度為56 ℃),72 ℃延伸1 min,循環(huán)35 次,循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。 陽性PCR 產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序,將得到的序列信息在GenBank 數(shù)據(jù)庫比對。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs 型肺炎克雷伯菌流行率 所檢測的124 株肺炎克雷伯菌株中,有17 株肺炎克雷伯確證為產(chǎn)ESBLs 菌株,流行率為13.7%(17/124)。

2.2 ESBLs 基因型分布 對17 株確證為產(chǎn)ESBLs型肺炎雷伯菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,有14 株擴(kuò)增出陽性條帶,3 株未擴(kuò)增出以上3 種基因型。 其中,有6 株菌屬于blaCTX-M基因型,10 株菌屬于blaSHV基因型,5 株菌屬于blaTEM基因型。 測序結(jié)果顯示,所有的blaCTX-M基因型均為blaCTX-M-14亞型;blaSHV基因型菌株中,7 株為blaSHV-1亞 型,各1 株分 別 屬 于blaSHV-11、blaSHV-26和blaSHV-28亞型;所有的blaTEM基因型均為blaTEM-1亞型。檢測結(jié)果還顯示,有3 株肺炎克雷伯菌同時攜帶2 種β-內(nèi)酰胺酶編碼基因,組合方式為blaSHV-1+blaCTX-M-14;有2 株肺炎克雷伯菌同時攜帶了3 種β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因,組合方式為blaTEM-1+blaSHV-1+blaCTX-M-14。 菌株ESBLs 基因型分布情況列于表1。

表1 肺炎克雷伯菌(n=17)ESBLs 基因型分布

3 討論

本試驗報道了來自國內(nèi)13 個省份的77 個大型規(guī)?；膛鲋挟a(chǎn)ESBLs 型肺炎克雷伯菌的流行狀況,流行率(13.7%)低于來自國內(nèi)的另一報道(42.0%)[11]。 然而,參考報道中的菌株僅來源于寧夏地區(qū)奶牛場,收集區(qū)域、牛場數(shù)及菌株數(shù)均有一定局限性[11];而本報道則探查了全國范圍規(guī)?；膛鲋挟a(chǎn)ESBLs 肺炎克雷伯菌的流行狀況,這在國內(nèi)尚屬首次。 來自人醫(yī)領(lǐng)域的報道顯示,人源性肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs 菌株陽性率為29.9% ～44.9%[12-14]。

ESBLs 多由質(zhì)粒介導(dǎo),可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在腸桿菌科細(xì)菌之間傳播,國內(nèi)已有不少關(guān)于產(chǎn)ESBLs 型大腸桿菌在奶牛場流行情況的報道。 王桂琴使用和本試驗相同的方法對內(nèi)蒙古呼和浩特市和上海市奶牛場分離的大腸桿菌進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)ESBLs 陽性率為10.3%[16];Ali 等收集中國16 個省份共1 252 株乳房炎大腸桿菌進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)有23.5%的大腸桿菌具有ESBLs 表型[8];趙俊利調(diào)查內(nèi)蒙古奶牛源沙門菌耐藥菌的ESBLs 分布情況,報道陽性率為85.7%[17]。 研究顯示,ESBLs 在體外的活性會下降,故體外檢測所得的ESBLs 流行率可能低于真實水平[18]。 因此,奶牛場的肺炎克雷伯菌的實際耐藥狀況可能比本調(diào)查結(jié)果更為嚴(yán)峻,獸醫(yī)以及相關(guān)管理人員對應(yīng)予以重視,合理地使用抗生素。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn),在產(chǎn)ESBLs 型肺炎克雷伯菌中,存在blaCTX-M、blaSHV和blaTEM三個基因型;其中,blaCTX-M-14、blaSHV-1和blaTEM-1是最常見的亞型。 劉保光等報道,我國雞源性肺炎克雷伯菌的常見ESBLs亞型為blaCTX-M-14、blaTEM-1、blaSHV-11型,其中blaCTX-M-14型檢出率最高[19],與本試驗結(jié)果相符。 人源性肺炎克雷伯菌常見的ESBLs 亞型為blaCTX-M-14、blaCTX-M-3和blaSHV-12[20],其中blaCTX-M-14占比最高,與本次試驗結(jié)果一致。 此外,共有3 株產(chǎn)ESBLs 型肺炎克雷伯菌不能確定基因型,可能是由于ESBLs 家族數(shù)量龐大,而本試驗只選取了最常見的3 種ESBLs 基因型進(jìn)行檢測,這些菌株可能屬于其他基因型。

此外,研究還發(fā)現(xiàn)了攜帶兩種及以上不同類型β-內(nèi)酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌。 不同類型β-內(nèi)酰胺酶對不同抗生素水解能力具有差異,因此,耐藥基因的整合會增加肺炎克雷伯菌對抗生素的耐藥性,最終增加臨床治療的難度。 以上研究結(jié)果提示我們,應(yīng)做好對ESBLs 菌株監(jiān)控,預(yù)防多重耐藥細(xì)菌產(chǎn)生。