張騰帥, 李巧玲, 賈青輝, 張召興, 劉京國(guó), 張艷英, 高 聰

(1.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 秦皇島066600 ;2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 昌平102206)

小腸腸球菌屬腸球菌屬,是人類和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分,通常在引起腹腔和盆腔感染所分離的混合菌絲中發(fā)現(xiàn),既往認(rèn)為腸球菌是對(duì)動(dòng)物無(wú)害的共棲菌,但近年研究已證實(shí)了腸球菌的致病力[1]。 在需氧革蘭陽(yáng)性球菌中,它是僅次于葡萄球菌重要的院內(nèi)感染致病菌,腸球菌亦可引起外感染。 腸球菌不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染,還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等[2-3]。

河北省秦皇島昌黎某鵝場(chǎng)的20 日齡左右雛鵝發(fā)生一起以精神沉郁、厭食、關(guān)節(jié)腫大為主要臨床表現(xiàn)的疾病。 感染率高,出現(xiàn)癥狀3 d 左右死亡。為了鑒定引起鵝發(fā)病的病原菌,通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化特性分析和16s rRNA 基因序列分析以及雛鵝致病性試驗(yàn),證實(shí)該雛鵝病由小腸腸球菌感染引起。 并通過(guò)藥敏試驗(yàn)測(cè)定其耐藥譜,為預(yù)防和控制該病流行提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來(lái)源 河北省秦皇島昌黎某鵝場(chǎng),20 日齡的雛鵝出現(xiàn)了精神沉郁、厭食、關(guān)節(jié)腫大為主要臨床表現(xiàn),病死20 日齡左右雛鵝。 無(wú)菌采集病鵝肝臟、腫大關(guān)節(jié)滲出液等組織進(jìn)行病原分離鑒定。

1.2 試劑和儀器 血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基,均購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司;藥敏紙片,購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;革蘭染色試劑,購(gòu)自青島博海生物技術(shù)有限公司;腸道菌鑒定試條,購(gòu)自法國(guó)梅里埃(bioMerieuxsa)公司;DL-2 000 Marker、2 ×Mix,均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;常用的試劑和主要儀器由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 7 日齡健康雛鵝10 只,購(gòu)自昌黎某孵化場(chǎng)。

2 方法

2.1 病原菌分離與鑒定 對(duì)病鵝進(jìn)行剖檢,無(wú)菌采集肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等器官組織,劃線接種于綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 ～18 h,選取圓形、較小、露珠樣優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng),革蘭染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

2.2 生化特性鑒定 取純化培養(yǎng)的病原菌,調(diào)整菌液濃度為2 麥?zhǔn)蠁挝?加入到Rapid ID 32 STREP 生化鑒定試劑條中,37 ℃培養(yǎng)4 ～8 h 后,用ATB 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。

2.3 細(xì)菌的16S rRNA 基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析 取100 μL 無(wú)菌水于EP 管內(nèi),用接種環(huán)將培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌接種到EP 管內(nèi),煮沸5 min,12 000 r/min 離心2 min,取上清作為PCR 模板,-20 ℃保存。 以提取的分離菌株的基因組DNA 為模板,用16S rRNA 通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：預(yù)混物12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA 模板2.0 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,72 ℃中延伸6 min,共30 個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠檢條帶,將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.4 致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[4]、[5],將10 只健康7 日齡雛鵝分為2 組,每組5 只,將分離菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃振搖培養(yǎng)12 h。 然后每只雛鵝注射0.2 mL(1 ×109CFU/mL ),對(duì)照組用同樣的方法注射等量的無(wú)菌生理鹽水。 接種12 h 后,觀察7 d,記錄每組雛鵝的發(fā)病及死亡情況,對(duì)死亡的雛鵝剖檢后,無(wú)菌取其肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定。

2.5 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

3 結(jié)果分析

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察 分離菌株在綿羊鮮血瓊脂平板培養(yǎng)上長(zhǎng)出白色、濕潤(rùn)的露珠樣圓形的小菌落;在普通瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出灰白色、圓形、針尖大小的菌落;染色鏡檢可見(jiàn),分離菌株為革蘭陽(yáng)性球菌,呈散在的鏈狀的球菌(圖1)。

圖1 分離菌株革蘭染色結(jié)果 (1 000 ×)

3.2 生化試驗(yàn) 用ATB 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌株進(jìn)行檢測(cè),鑒定結(jié)果為小腸腸球菌(見(jiàn)表1),評(píng)定結(jié)果為99.3%。

表1 分離菌株生化特性鑒定結(jié)果

3.3 分離菌16S rRNA 測(cè)序與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 對(duì)分離菌株(HQ150506)進(jìn)行16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增出1 500 bp 左右大小的目的片段(見(jiàn)圖2)。 將分離菌株測(cè)序后,在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 搜索比對(duì),擇取部分參考菌株,采用DNAStar生物軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分離菌株與小腸腸球菌關(guān)系較近聚為一支,分離菌株HQ150506 基因序列與參考菌株小腸腸球菌基因序列同源性在99.6% ～100%(見(jiàn)圖3)。

圖2 分離菌株,6S rRNA PCR 結(jié)果

圖3 分離菌株16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組雛鵝在攻毒24 h后,雛鵝出現(xiàn)了背毛逆立,精神萎靡、厭食、關(guān)節(jié)腫大等現(xiàn)象,發(fā)病率為100%,剖檢發(fā)病雛鵝,可見(jiàn)肝、脾腫大,肝表面有針尖大小的出血點(diǎn),從雛鵝的肝臟和腫大關(guān)節(jié)處分離到小腸腸球菌。 對(duì)照組5 只雛鵝健康存活,因而證實(shí)分離菌具有很強(qiáng)的致病性。

3.5 藥敏試驗(yàn) 由表2 結(jié)果顯示,分離菌對(duì)慶大霉素、頭孢唑林、青霉素、卡那霉素耐藥;對(duì)氨芐西林、磷霉素、氟苯尼考、左氧氟沙星等抗菌藥物敏感;對(duì)紅霉素、大觀霉素中敏。

4 討論

腸球菌是近年來(lái)禽類養(yǎng)殖的常見(jiàn)疾病,危害極大。 唐曉丹等[6]、易愛(ài)玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)小腸腸球菌屬腸球菌屬,是人類和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分,通常在引起腹腔和盆腔感染所分離的混合菌絲中發(fā)現(xiàn),以前認(rèn)為腸球菌是對(duì)人類無(wú)害的共棲菌,但近年研究已發(fā)現(xiàn)了腸球菌的致病力,因而對(duì)腸球菌的研究也愈發(fā)受到人們的重視。 為研究小腸腸球菌,本試驗(yàn)首先從患病鵝關(guān)節(jié)提取出優(yōu)勢(shì)致病菌。 經(jīng)過(guò)菌體形態(tài)觀察,生理生化特性鑒定,初步判斷該致病菌為桿菌屬,為證實(shí)所得結(jié)果,利用該菌16S rRNA 的基因序列并運(yùn)用系統(tǒng)分子學(xué)進(jìn)行同源性分析,進(jìn)一步證明該菌為小腸腸球菌。 小腸腸球菌是禽類養(yǎng)殖的一種重要病原菌,極易引起幼年動(dòng)物感染發(fā)病[8-9]。 在狄婷婷等“致鵝敗血癥糞腸球菌的分離與鑒定”中記述,小腸腸球菌可引起病禽精神沉郁、厭食、腹瀉、關(guān)節(jié)腫大等癥狀[10]。 與本次試驗(yàn)病鵝病例癥狀一致。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

腸球菌是條件致病菌,但近年來(lái)抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,使腸球菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥,并成為導(dǎo)致感染的重要致病菌,為臨床治療帶來(lái)了困難。 李春艷等人研究發(fā)現(xiàn),在耐藥菌株中氨基苷類高水平耐藥菌株占了較大的比例,使得氨基苷類與作用于細(xì)胞壁的藥物包括青霉素類、糖肽類的聯(lián)合作用消失[11]。 張波等[12]對(duì)2012 -2015 年腸球菌屬臨床感染及耐藥性變遷情況進(jìn)行了研究,共檢出腸球菌252 株,其中糞腸球菌148 株,屎腸球菌91株,鳥(niǎo)腸球菌6 株,鉛黃腸球菌4 株,鶉雞腸球菌2株,耐久腸球菌1 株,未檢出鵝小腸腸球菌;糞腸球菌、屎腸球菌對(duì)于萬(wàn)古霉素耐藥不同年份檢出不同,并占有一定比率,且萬(wàn)古霉素耐藥菌株近幾年檢出率呈下降趨勢(shì),其他腸球菌未檢出萬(wàn)古霉素耐藥株。 本次鵝小腸腸球菌藥敏試驗(yàn)證明,該菌對(duì)氨芐西林、磷霉素、氟苯尼考、左氧氟沙星等抗菌藥物敏感;對(duì)慶大霉素、頭孢唑林、青霉素、卡那霉素等抗菌藥物耐藥。 故防治本病時(shí)需根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)用藥。