仇志凱，曲 元，馬 超，律廣富， 常詩卓，葉鴻 博，林 賀，林 喆*

（1.長春中醫(yī)藥大學， 長春 130117 ；2.長春人民藥業(yè)集團有限公司 公益管理平臺， 長春 130021）

哈蟆油（Oviductus Ranae）為中國林蛙雌蛙輸卵管的干制品，是其主要藥用部位，自1985年被《中國藥典》收錄。性平，歸腎、肺經(jīng)，味甘、咸，具有養(yǎng)陰潤肺、補腎益精、健脾養(yǎng)胃之功效[1-2]。目前，對于支氣管哮喘的發(fā)病機制，西醫(yī)認為，多是由氣道炎癥導致[3]，廣泛認同的是IgE介導的I型超敏反應導致的炎性浸潤。祖國醫(yī)學則認為，哮喘是由于肺腎氣虛所致，《類癥治裁·喘證》指出：“肺為氣之主，腎為氣之根，肺主出氣，腎主納氣，陰陽相交，呼吸乃和，若出入升降失常，斯喘作焉”[4-5]。本研究從哈蟆油滋陰潤肺的傳統(tǒng)功效入手，分析其對豚鼠血中炎性因子及肺部病理變化的影響，探討哈蟆油對哮喘的現(xiàn)代藥理作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF健康豚鼠，60只，體質量250～300 g，長春市億斯實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（吉）- 2016-0004。

1.2 試劑 哈蟆油（通化鼎參藥業(yè)），醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司，160226），卵清蛋白（Sigma，#SLBS6919），氯化鈉（北京化工廠，20170117），水合氯醛（天津大茂化學試劑廠，20160320），無水乙醇（北京化工廠，20170515），4%多聚甲醛固定液（長春金泰化玻，20170621），二甲苯（北京化工廠，20170410），蘇木精染液（長春賽默瑞特，SM-RT-001），伊紅染液（長春賽默瑞特，SM-RT-007），IL-4、IL-5、IgE酶聯(lián)免疫試劑盒（上海源葉，E20170601A）。

1.3 儀器 WP-UP-III-40精密型超體純水機（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司），MS-PB型磁力攪拌器（DRAGON LAB），JA2003B分析天平（上海越平科學儀器有限公司），JSC-202超聲霧化器（遼寧鞍山電子醫(yī)療儀器廠），Multiskan FC型酶標儀（上海賽默飛世爾），TS-12U型生物自動組織脫水機（湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），TB-718D型生物組織包埋機（湖北泰維科技），HM340E型切片機（Thermo Scientifi c），TR-180型生物組織全自動染色機（湖北泰維科技），DM2500型顯微鏡（德國徠卡）。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 造模藥的制備 生理鹽水：4.5 g NaCl，溶于500 mL dd H2O；10%卵清蛋白：準確稱取卵清蛋白5 g，溶于50 mL生理鹽水；1%卵清蛋白：準確稱取卵清蛋白2.5 g，溶于250 mL生理鹽水。

2.1.2 治療藥的制備 地塞米松：根據(jù)陽性組豚鼠體質量，按給藥量1 mg/kg、給藥體積1 mL/100 g稱取地塞米松并溶于相應蒸餾水中；哈蟆油高、中、低劑量藥物的制備：根據(jù)給藥量400、200 、100 mg/kg稱取蛤蟆油，按給藥體積1 mL/100 g用相應ddH2O充分泡發(fā)24 h后，勻漿機制備成混懸液。

2.2 分組 60只健康豚鼠，每組10只，按體質量隨機分成空白組、模型組、陽性對照組（地塞米松，1 mg/kg）、哈蟆油高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg）。

2.3 造模 適應性飼養(yǎng)1周后，各組腹腔注射給予1 mL的10%卵清蛋白，腹腔注射后第8天開始，除空白組外，各組豚鼠分別放入霧化誘喘儀容器內(nèi)，用1%卵清蛋白進行霧化吸入激發(fā)誘喘5 mim（首次霧化時，若出現(xiàn)呼吸急促，尖叫，四肢癱軟癥狀，立刻取出豚鼠），隔日1次，共計7次；空白組用等量生理鹽水進行同等操作[6-8]。

2.4 給藥 腹腔注射后第8天開始，每次霧化前30 min進行灌胃給藥，空白組和模型組給予生理鹽水、陽性組給予地塞米松1 mg/kg、哈蟆油高、中、低劑量組給予哈蟆油混懸液400、200 、100 mg/kg，給藥體積均為1 mL/100 g。

2.5 動物處理 末次霧化20 min后，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）予以麻醉，進行采樣。

2.5.1 炎性因子檢測 腹主動脈取血，置于常規(guī)10 mL的EP管中，3 000 r/min離心10 min后，分離血清，按照試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清中IL-4、IL-5、IgE的含量。

2.5.2 病理切片的取材及制作[9-10]打開胸腔，分離右中肺組織，置于4%多聚甲醛固定液固定，經(jīng)70%～100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，進行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染液染色，通過病理圖像分析系統(tǒng)觀察肺部組織病理變化情況。

2.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較進行t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對血清中IL-4、IL-5、IgE含量的影響 給藥后與模型組相比，陽性對照組、哈蟆油高、中劑量組均能顯著降低IL-4、IL-5、IgE的含量（P＜0.01），而哈蟆油低劑量組的療效稍弱一些（P＜0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠外周血中IL-4、IL-5、IgE含量變化（，n = 10）

表1 各組豚鼠外周血中IL-4、IL-5、IgE含量變化（，n = 10）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 IL-4/（pg/mL） IL-5/（pg/mL） IgE/（μg/mL）空白組 6.76±1.39 11.26±1.66 33.64±4.66模型組 11.81±3.84##28.53±3.62##67.88±6.18##陽性對照組 7.18±5.08△△13.26±3.20△△37.13±6.49△△哈蟆油高劑量組 8.51±2.70△△12.49±3.79△△34.06±9.85△△哈蟆油中劑量組 9.05±1.50△△13.93±2.40△△38.85±8.91△△哈蟆油低劑量組10.96±6.76△ 22.54±5.44△ 56.39±4.02△

3.2 肺部組織結構的病理改變 顯微鏡下觀察肺部組織的病理改變，通過病理圖像處理軟件獲取圖像：與空白組相比，其余各組均出現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤、組織平滑肌增厚以及氣道變窄現(xiàn)象。模型組最為顯著，表現(xiàn)為大量炎性細胞聚集對組織造成炎性浸潤、平滑肌增厚、氣道變窄；與模型組相比，陽性對照組和哈蟆油高劑量組的炎性細胞明顯減少、組織增厚現(xiàn)象顯著降低；與陽性對照組、哈蟆油高劑量組相比，哈蟆油中、低劑量組炎性細胞有所增加，組織增厚，但相對于模型組，依然明顯降低。病理結果提示，哈蟆油可降低哮喘豚鼠的肺部組織的炎性浸潤及氣道損傷，從而減輕豚鼠哮喘癥狀。

4 討論

目前，對于支氣管哮喘的發(fā)病機制，在西醫(yī)臨床還未完全明確，主要有氣道重塑、IgE介導的I型超敏反應、炎性浸潤等。其中被廣泛認同的是I型超敏反應導致的炎性浸潤，大量研究[11]證明，哮喘發(fā)生時，機體的Th1/Th2會出現(xiàn)嚴重的失衡現(xiàn)象，導致Th2占主導，產(chǎn)生大量的IL-4、IL-5（其中IL-4是其特征性細胞因子），并進一步促進免疫球蛋白IgE和嗜酸性粒細胞EOS的活化和聚集，使氣道出現(xiàn)大量黏液并伴隨纖維化增厚現(xiàn)象。所以，檢測IL-4、IL-5以及IgE的含量，對于哮喘的判別有一定的說明意義。

中醫(yī)認為，哮喘是“水濕內(nèi)聚為痰，伏藏于肺，遇外邪誘發(fā)，痰阻氣道發(fā)為哮病?！薄端貑枴の宀厣善分赋觯骸爸T氣者皆屬于肺?！狈闻K受損，則一身之氣受損，運行不暢，致虛致瘀，氣屬陽，久瘀則生熱，灼傷陰液，轉變?yōu)榉侮幪撟C。哈蟆油則兼具養(yǎng)陰潤肺、補腎益精的雙重作用[12-15]。

通過本實驗證明，哈蟆油可顯著降低豚鼠血清中的IL-4、IL-5、IgE的含量、并且顯著減少豚鼠的肺部組織的炎性浸潤，避免炎性因子對肺部造成損傷；同時降低組織平滑肌增厚，氣道狹窄等癥狀，利于肺氣及津液的流動，減輕“喘證”的發(fā)作，其作用機制應該與調節(jié)機體的Th1/Th2失衡、降低炎性細胞的分泌，改善肺部氣道重塑有關，從而緩解機體的哮喘癥狀。其相應的信號通路，有待進一步研究證實。

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