馬雁南 ，楊小頎

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.寶雞市第二中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 寶雞 721300；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖科，陜西 咸陽(yáng) 712046）

妊娠是一個(gè)獨(dú)特的生理現(xiàn)象，胎兒與母體間的免疫調(diào)節(jié)既矛盾又復(fù)雜[1]。胚胎中帶有一半的父系抗原，作為一種半異己抗原，勢(shì)必會(huì)激發(fā)母體的免疫應(yīng)答，而遭到母體的排斥。但令人驚嘆的是，正常妊娠并未出現(xiàn)排斥現(xiàn)象，恰恰相反，母胎間“和平相處”，這就是母胎免疫耐受。這一現(xiàn)象的形成機(jī)制格外復(fù)雜，包含多種免疫反應(yīng)，免疫遺傳以及子宮局部的免疫調(diào)節(jié)等。近年來(lái)隨著生殖免疫研究的精準(zhǔn)化深入，發(fā)現(xiàn)妊娠免疫耐受的形成與母胎界面局部的細(xì)胞因子保護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，其中，最為經(jīng)典的是Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡模式。Th1型細(xì)胞和Th2型細(xì)胞是由Th0分化而來(lái)的。Th1型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包含IFN-γ、TNF-α、IL-2，可對(duì)胚胎造成免疫損傷。Th2型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，對(duì)胚胎起免疫保護(hù)作用。正常妊娠時(shí)母胎界面是以Th2型反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的[2-6]。

黃芩初載于《本經(jīng)》，其性涼味苦，具有清熱安胎的作用[7]。中藥安胎歷史悠久，黃芩在諸多安胎方劑中出現(xiàn)，沿用至今，其安胎效果已被臨床實(shí)踐所證實(shí)[8]，但對(duì)其作用機(jī)制尚不明了。本實(shí)驗(yàn)選用LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠模型，旨在研究黃芩是如何通過調(diào)節(jié)子宮局部母-胎界面免疫狀態(tài)來(lái)發(fā)揮安胎作用，從免疫學(xué)角度探討黃芩的安胎機(jī)理，為中醫(yī)學(xué)中黃芩“清熱安胎”理論提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide from E coli.O111B4），Sigma公司產(chǎn)品；黃芩苷（Baicalin），購(gòu)于博奧生物醫(yī)藥科技有限公司；小鼠INF-γ、IL-4ELISA測(cè)試盒，BioSource產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑（Aprotinin），Biosharp產(chǎn)品。1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SFP級(jí)昆明雌鼠，體質(zhì)量20～22 g（購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后，陰道涂片法挑選出處于動(dòng)情期雌鼠，與雄鼠2:1合籠交配，次晨檢出陰栓者，記為孕0 d。1.3 動(dòng)物分組及處理 受孕小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、LPS模型（B組）和黃芩苷治療組（C組）。B、C組孕鼠分別于孕7 d給予尾靜脈注射LPS 0.1 μg（0.2 mL）制作流產(chǎn)模型，A組孕7 d尾靜脈注射PBS 0.2 mL。B組自孕4 d開始連續(xù)灌胃（磷酸鹽緩沖液0.4 mL/d），共4 d；C組自孕4 d開始連續(xù)灌胃（黃芩苷液0.4 mL/（mg.d），共4 d。孕9 d處死所有孕鼠。

1.4 胚胎吸收率和流產(chǎn)率計(jì)算 孕9 d頸椎脫臼法處死孕鼠。打開腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長(zhǎng)情況，記錄胚胎著床數(shù)目和胚胎吸收數(shù)目。發(fā)育正常的子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤。而發(fā)育異常子宮呈黑紫或褐色，內(nèi)可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失。解剖鏡下觀察，模糊一片無(wú)正常胚胎結(jié)構(gòu)。胚胎吸收率及流產(chǎn)率的計(jì)算公式：胚胎吸收率=吸收胚胎數(shù)/（吸收胚胎數(shù)＋存活胚胎數(shù)）×100% 。流產(chǎn)率=流產(chǎn)母鼠數(shù)/試驗(yàn)組母鼠總數(shù)×100%

1.5 試驗(yàn)取樣 在冰盒上完整取出子宮，除去系膜及脂肪組織后稱重。縱向剖開子宮，完整剝離胚胎后稱量子宮凈重。剪下右側(cè)子宮，稱重后加入pH＝7.4磷酸鹽緩沖液（內(nèi)含6倍量0.75 μg/mg蛋白酶抑制劑），立即在低溫環(huán)境中進(jìn)行勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上清液分裝，- 80 ℃凍存，用于ELSIA測(cè)定IFN-γ、IL-4的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用Excel 2000和SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，單變量方差分析組間差異顯著性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組流產(chǎn)率比較 A組的流產(chǎn)率為20%，正常胚胎居多，胚胎組織新鮮，少見出血、壞死，胚胎吸收率為3.4%。B組中10只孕鼠均發(fā)生流產(chǎn)，子宮內(nèi)無(wú)存活胚胎，部分胚胎已經(jīng)溶化，流產(chǎn)率及胚胎吸收率均為100%，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。C組的流產(chǎn)率為20%，胚胎吸收率為3.3%，近似A組，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與B組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。說(shuō)明LPS可致孕鼠發(fā)生流產(chǎn)，而黃芩苷能夠?qū)筁PS致小鼠流產(chǎn)的作用，具有安胎功效。

2.2 對(duì)子宮重量的影響 3組之間比較，B組的小鼠除胚子宮的重量最?。?.043±0.021 5）g，與A、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組（0.110±0.017 8）g、C組（0.115±0.012 2）g，2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 3組子宮組織中IFN-γ含量的變化 B組與A、C組相比，差異極顯著，小鼠的子宮組織中IFN-γ含量明顯升高（P＜0.01）。C組小鼠的子宮組織中IFN-γ的含量無(wú)明顯升高，與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 對(duì)IL-4含量變化的影響 B組小鼠子宮組織中IL-4含量最低，與A、C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組小鼠的子宮組織中IL-4含量最高，見表1。

表1 3組子宮組織勻漿中IFN-γ、IL-4的含量比較（，n = 10） pg/mL

表1 3組子宮組織勻漿中IFN-γ、IL-4的含量比較（，n = 10） pg/mL

注：與空白對(duì)照組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 IFN-γ IL-4空白對(duì)照組 20.413±0.140 24.650±0.213細(xì)菌脂多糖組 65.647±0.380 ## 9.413±0.334#黃芩苷組 16.409±0.081 ## 38.179±0.134#

3 討論

隨著科技的突飛猛進(jìn)，生殖免疫學(xué)家對(duì)于妊娠免疫耐受這一特殊的生理現(xiàn)象已轉(zhuǎn)向精準(zhǔn)研究。母胎界面微環(huán)境的穩(wěn)定是否與細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，已成為這一研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。TAU GZ等[9]研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠孕婦體內(nèi)的IFN-γ的含量顯著降低，而IL-4的含量則明顯增高。IFN-γ能增加Th1型細(xì)胞因子的活性，并可阻遏Th2型細(xì)胞的分泌，降低IL-4、IL-10的活性。與此同時(shí)，IFN-γ還阻止胎盤的發(fā)育及滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖。而IL-4則是維系妊娠免疫耐受的關(guān)鍵因子，影響Th0細(xì)胞分化成為Th2細(xì)胞。研究[10]表明，如小鼠體內(nèi)缺乏IL-4，則無(wú)Th2型反應(yīng)，其流產(chǎn)率及胚胎吸收率也驟然上升。

細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的流產(chǎn)小鼠是經(jīng)典的流產(chǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其致流產(chǎn)機(jī)制主要是影響孕鼠的免疫功能，通過活化Th1型細(xì)胞，釋放大量的IFN-γ，刺激巨噬細(xì)胞分泌過量的TNF-α，放大子宮局部的細(xì)胞免疫效應(yīng)，使母胎微環(huán)境中的Th1型細(xì)胞因子的整體水平上調(diào)，破壞Th1/Th2的平衡，使其偏向Th1型，致使流產(chǎn)發(fā)生[11]。

流產(chǎn)又稱為“滑胎”“胎動(dòng)不安”，中醫(yī)認(rèn)為，其病因多與母胎腎氣不固、沖任虧損所致。腎藏精主生殖，為先天之本。腎氣虛弱易導(dǎo)致滑胎或胎動(dòng)不安。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血熱妄行、熱壅氣滯、血瘀阻滯可影響脾腎功能，進(jìn)而導(dǎo)致胎動(dòng)不安、滑胎。故需清熱涼血，健脾補(bǔ)腎[12]。金元朱震亨曰“俗以黃芩為寒性而不敢用，蓋不知胎孕宜清熱涼血，血不妄行，乃能養(yǎng)胎”，并稱其為“安胎圣藥”。黃芩中的有效成分為黃酮類，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷等[13]。大量生殖免疫研究發(fā)現(xiàn)，黃芩及其有效成分能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，尤其對(duì)妊娠期母-胎微環(huán)境的發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。張曉思[14]使用黃芩苷提前干預(yù)妊娠小鼠，觀察著床期小鼠子宮微環(huán)境的變化，發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠提升體內(nèi)IL-10含量，降低IFN-γ含量，使小鼠子宮局部呈現(xiàn)Th2型反應(yīng)。賴楠楠[15]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能有效降低 URSA小鼠胚胎吸收率，調(diào)節(jié)母胎界面DC的功能變化，誘導(dǎo)母胎免疫耐受，治療URSA。

新教材的改變對(duì)教師角色的自身定位是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。知識(shí)的易接觸性意味著教師將不再是其唯一持有者，在單獨(dú)的字音教學(xué)環(huán)節(jié)，教師與學(xué)生只是資源共享關(guān)系。因此如何發(fā)揮教師的引導(dǎo)作用才是值得深思的問題。教師應(yīng)首先明確自身優(yōu)勢(shì)，引導(dǎo)學(xué)生將社會(huì)經(jīng)驗(yàn)回歸書本，將生活實(shí)際抽象概括，得出最終結(jié)論。

本試驗(yàn)中，給予黃芩苷提前干預(yù)治療的LPS流產(chǎn)模型小鼠，其胚胎存活率高，并且胚胎組織新鮮，發(fā)育正常，色澤光滑紅潤(rùn)，無(wú)瘀血、出血現(xiàn)象。流產(chǎn)率及吸收率明顯低于LPS組（P＜0.01），子宮重量明顯高于LPS組。子宮局部的IFN-γ含量最低，而IL-4含量最高，與LPS組比較，P＜0.01。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，LPS致流產(chǎn)的機(jī)制可能是通過升高子宮局部的IFN-γ含量，降低IL-4的含量，使Th1/Th2比例偏向Th1反應(yīng)，這與之前的研究報(bào)道相符合。而黃芩苷的作用恰好相反，其對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的流產(chǎn)，阻礙IFN-γ的分泌，刺激IL-4的分泌，調(diào)節(jié)子宮局部免疫功能向著Th2占優(yōu)勢(shì)的平衡模式轉(zhuǎn)變，具有良好的安胎效果。

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