汪元?！畎l(fā)滿　董慶玲　張培莉　劉　冀　李　蓉　李曉平　敬澤慧

(青海大學附屬醫(yī)院老年科，青?！∥鲗帯?10001)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆，病因及病理生理改變受環(huán)境及遺傳等多種因素影響，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制尚未闡明〔1，2〕。miRNA是一類廣泛存在于哺乳動物中高度保守的非編碼小RNA分子，能夠與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)特異性結合，進而抑制或降解靶基因mRNA，實現(xiàn)其在轉錄后水平的調控。有研究表明超過70%的mRNA能夠表達于腦內，對神經元細胞及膠質細胞發(fā)揮調控作用〔3〕。AD血清中存在著多種miRNA的異常表達，但具體的作用機制尚不明確〔4～6〕。本研究旨在探討miR-15a在AD中的作用及相關機制。

1　材料和方法

1.1材料來源2016年 6 月至 2017年 4月經青海大學附屬醫(yī)院老年內科診斷及治療的AD患者血液標本30例為AD組，男20例，女10例，平均年齡(77.9±12.4)歲；正常健康血液樣本30例為對照組，男14例，女16例，平均年齡(73.4±11.8)歲。大鼠神經細胞株(PC12)細胞購于中國科學院上海細胞庫。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2主要試劑及儀器TRIZOL總RNA提取試劑、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒均購自北京天根生物化學試劑公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗B淋巴細胞瘤(Bcl)-2，c-myc，還原型輔酶Ⅱ(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3及Caspase9活性檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；miR-15a NC及miR-15a mimics由廣州銳博生物技術有限公司合成。168-1000XC型酶標儀，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀購于美國BD公司；Labworks凝膠掃描成像系統(tǒng)購自美國UVP公司；PTC-250梯度PCR儀購自美國MJ Research 公司；DYY-Ⅲ穩(wěn)壓電泳儀購自北京六一儀器廠；5417R低溫高速離心機，Biophotometer核酸蛋白檢測儀購自德國Eppendorf。

1.3Realtime PCR檢測miR-15a表達水平TRIZOL試劑一步法提取血液白細胞層總RNA，紫外分光光度法測定總RNA的純度，根據(jù)吸光值計算樣品總RNA純度，當RNA樣品純度在1.8～1.9，說明提取的總RNA純度好，能夠滿足下一步實驗的要求。取焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的0.2 ml PCR反應管，加入樣品總RNA 5 μg、隨機引物1 μg，再加DEPC dd H2O補足至20 μl，70℃變性5 min，進行cDNA第一鏈合成?；赟YBR Green I熒光分析的Realtime PCR分析，預變性95℃，15 min；變性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40個循環(huán)。用2-△△CT法鑒定miR-15a的表達量，其中△△CT=(待測組目的基因CT值-待測組內參基因CT值)-(對照組目的基因CT值-對照組內參基因CT值) 。

1.4實驗分組采用20 μmol/L的淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導PC12細胞制作AD細胞模型，并將誘導成功的PC12細胞隨機分為模型組、陰性對照組、促進組，其中陰性對照組及促進組分別利用脂質體LipofectamineTM3000轉染miR-15a NC及miR-15a mimics；另外選取不加任何藥物刺激的PC12細胞作為正常對照組。

1.5噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力將5×103個PC12細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，加入20 μl的MTT孵育4 h后，將上清液棄去，加入150 μl的二甲基亞砜使結晶物溶解，酶標儀測定OD570 nm值。

1.6Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡將8×103個PC12細胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，每組收集1×105/ml個細胞，加入結合緩沖液吹打混勻后，依次加入5 μl的Annexin V-FITC及PI吹打混勻，并于室溫下避光孵育10 min，最后進行流式檢測，對細胞凋亡情況進行分析。

1.7細胞中Caspase3及Caspase9活性的檢測將8×103個PC12細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，利用胰蛋白酶消化細胞并收集，后按照Caspase3及Caspase9活性試劑盒說明書檢測活性，酶標儀測定OD405 nm值，OD值即代表Caspase活性。

1.8Western印跡檢測Bcl-2及c-myc蛋白表達將8×103個PC12細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，冰浴條件下收集細胞并裂解，獲得的上清液即是總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品煮沸變性。制作濃縮膠及分離膠，并上樣，進行凝膠電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜，次日二抗孵育，最后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.9統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1miR-15a在AD和對照組血液中的表達AD組miR-15a表達量(11.201±6.55)低于對照組(20.58±5.62)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞中miR-15a表達量的影響與正常對照組(4.89±0.48)比較，模型組及陰性對照組miR-15a表達量(1.95±0.20，1.94±0.19)顯著降低(P<0.01)；與模型組及陰性對照組比較，促進組(4.78±0.48)顯著提高(P<0.01)。

2.3miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞活力及細胞凋亡的影響如表1所示，與正常對照組比較，模型組及陰性對照組細胞活力顯著降低，細胞早期凋亡率及晚期凋亡率均顯著提高(均P<0.01)；與模型組及陰性對照組比較，促進組細胞活力顯著提高，細胞早期凋亡率及晚期凋亡率均顯著降低(均P<0.01)。

表1　miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞活力及細胞凋亡的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組及陰性對照組比較：2)P<0.01；下表同

2.4miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞中Caspase3及Caspase9活性的影響與正常對照組比較，模型組及陰性對照組細胞中Caspase3及Caspase9活性顯著提高，與模型組及陰性對照組比較，促進組均顯著降低(均P<0.01)。見表2。

2.5miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞中Bcl-2及c-myc蛋白表達的影響與正常對照組比較，模型組及陰性對照組細胞中Bcl-2及c-myc蛋白表達量顯著下調，與模型組及陰性對照組比較，促進組均顯著上調(均P<0.01)。見表2，圖1。

表2　miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞中Caspase3、Caspase9活性及Bcl-2、c-myc蛋白表達的影響

圖1　miR-15a mimics對Aβ25～35誘導的PC12細胞中Bcl-2及c-myc蛋白表達的影響

3　討　論

Hill等〔3〕發(fā)現(xiàn)了AD患者腦組織中存在著miRNA的異常表達，也在AD患者外周血及腦脊液中發(fā)現(xiàn)了miRNA(包括miR-29，miR-15，miR-107，miR-181及miR-146等)的差異性表達，這些miRNA可能直接或間接通過調控靶基因的表達或降解參與AD的發(fā)生發(fā)展〔3〕。miR-15家族包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424、miR-497、miR-503及miR-646等。其中miR-15a位于人染色體13q14區(qū)域，是第一個被報道與腫瘤發(fā)生密切相關的miRNA，在眾多腫瘤組織中表達下調甚至缺失〔7〕，Liu等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)AD新西蘭大白兔模型腦組織中miR-15a表達量下調。Satoh等〔5〕通過miRNA序列數(shù)據(jù)分析48例AD患者及22例正常對照血液中miRNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)miR-15a在AD血液中表達量下調。Bekris等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織、腦脊液及血液中miR-15a表達量下調。但miR-15a在AD發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未見報道。本研究結果與以往研究一致〔4～8〕，miR-15a在AD血液中低表達，提示miR-15a在AD發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

AD患者海馬及皮層中Aβ的沉積能夠選擇性地損傷海馬神經元或皮層的膽堿神經元，是AD等神經退行性疾病發(fā)生過程中神經元最終的結局，也是AD的主要病理特征。本研究參考相關文獻〔8，9〕，結果表明miR-15a mimics能顯著提高Aβ誘導的PC12細胞活力，且對Aβ誘導的PC12細胞凋亡具有顯著的抵抗作用。細胞凋亡受多種基因調控，細胞凋亡基因是其中一種，Bcl-2是最為常見的抑制細胞凋亡蛋白，能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號傳遞到Caspase家族，促進細胞存活與增殖。Caspase家族蛋白正常情況下以無活性酶原形式存在，在受到上游凋亡信號誘導后，Caspase9被活化，并通過級聯(lián)放大反應，將凋亡信號傳遞到Caspase3，最終誘導細胞凋亡。另外c-myc是原癌基因myb轉錄因子的一種，能夠調控多種基因表達，進而參與細胞的增殖、細胞周期等。研究顯示Bcl-2及c-myc是miR-15a下游靶基因〔7〕，本研究結果表明miR-15a mimics能顯著降低Caspase3、9活性，并上調Bcl-2、c-myc表達，進而抑制Aβ誘導的PC12細胞凋亡。

1Bature F，Guinn BA，Pang D，etal.Signs and symptoms preceding the diagnosis of Alzheimer′s disease：a systematic scoping review of literature from 1937 to 2016〔J〕.BMJ Open，2017；7(8)：e15746.

2郭敏，李樹民，張弘，等.阿爾茲海默病的表觀遺傳學機制研究進展〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2014；30(3)：232-4.

3Hill JM，Lukiw WJ.MicroRNA (miRNA)-mediated pathogenetic signaling in Alzheimer′s disease (AD)〔J〕.Neurochem Res，2016；41(1-2)：96-100.

4Liu QY，Chang MN，Lei JX，etal.Identification of microRNAs involved in Alzheimer′s progression using a rabbit model of the disease〔J〕.Am J Neurodegener Dis，2014；3(1)：33-44.

5Satoh J，Kino Y，Niida S.MicroRNA-seq data analysis pipeline to identify blood biomarkers for Alzheimer′s disease from public data〔J〕.Biomark Insights，2015；10：21-31.

6Bekris LM，Lutz F，Montine TJ，etal.MicroRNA in Alzheimer′s disease：an exploratory study in brain，cerebrospinal fluid and plasma〔J〕.Biomarkers，2013；18(5)：455-66.

7韓旭，陳松，張濟，等.miR15a靶蛋白依賴性的功能研究進展〔J〕.生命科學研究，2013；17(5)：441-6.

8袁芳，徐琦，盛磊，等.瑣瑣葡萄多糖對β淀粉樣蛋白誘導PC12細胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(19)：5372-3.

9劉玲，王淑英，王建剛.PI3K/Akt通路在芍藥苷抗Aβ_(25-35)誘導PC12細胞凋亡中的作用〔J〕.中國中藥雜志，2014；39(20)：4045-9.