葛佳威　程正健　

(深圳市寶安第二人民醫(yī)院(集團)總醫(yī)院中醫(yī)科，廣東　深圳　518104)

1深圳市寶安第二人民醫(yī)院(集團)總醫(yī)院超聲科

順鉑及其他鉑類抗腫瘤藥是宮頸癌的一線化療用藥，但易發(fā)生腎毒性、神經(jīng)毒性、嚴重消化道反應(yīng)等不良反應(yīng)，限制順鉑的臨床應(yīng)用〔1，2〕。姜黃素是一種味微苦的結(jié)晶粉末，主要從天南星科和姜科植物的根莖中提取而來〔3〕。實驗證明姜黃素具有抗腫瘤作用，具有抗癌廣譜、不良反應(yīng)小的優(yōu)點，可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對腫瘤細胞生長的信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生阻斷作用，抑制調(diào)節(jié)腫瘤細胞黏附分子表達及腫瘤血管生成〔4〕。本研究旨在探討不同劑量姜黃素對宮頸癌裸鼠移植瘤生長及瘤組織中巨噬細胞移動抑制因子(MIF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達水平的影響。

1　材料與方法

1.1動物模型建立與實驗處置

1.1.1細胞培養(yǎng)人宮頸癌Caski細胞，購于中科院上海細胞庫，培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期的Caski細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，無血清RIMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，采用含25% Matrigel的無血清RIMI-1640培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為1.0×107/ml。

1.1.2模型建立35只SPF級BALB/c-nu雌性裸小鼠，鼠齡4～5 w，體重15～20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。抽取Caski細胞混懸液200 μl(約2.0×106細胞)，將其接種于裸鼠的右側(cè)腋窩外側(cè)皮下。每天觀察接種部位有無出血和破潰，成瘤標(biāo)準(zhǔn)為移植瘤達到5 mm×5 mm。

1.1.3實驗分組及處置35只小鼠成瘤成功后，按數(shù)字隨機法將動物模型分為5組：陰性對照組、順鉑組(3 mg·kg-1·d-1)、姜黃素低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、中劑量組(100 mg·kg-1·d-1)和高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)，每組各7只。陰性對照組給予羧甲基纖維素鈉灌胃15 d。順鉑組每隔3 d腹腔注射給藥，共5次。姜黃素組連續(xù)灌胃給藥15 d。本研究動物實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，實驗過程遵守《實驗動物管理條例》。

1.2裸鼠體重、移植瘤體積及瘤重的監(jiān)測停藥24 h后處死各組裸鼠，測量裸鼠體重，剝?nèi)×鲶w，測量移植瘤體積和瘤重，計算抑瘤率，將瘤體置于液氮中保存。

1.3實時定量PCR試驗(RT-PCR)取出液氮保存的移植瘤組織，采用Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度(OD260 nm/OD280 nm比值)，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司)。見表1。定量PCR擴增儀(美國ABI公司) 檢測MIF和VEGF表達水平。qRT-PCR擴增體系為10 μl，反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示MIF和VEGF相對表達量。

表1　RT-PCR引物序列

1.4蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western印跡)取出液氮保存的移植瘤組織，加入RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA試劑盒(美國Thermo公司)檢測組織總蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，加入羊抗大鼠單克隆抗體MIF(美國Santa公司)，羊抗大鼠單克隆抗體VEGF(美國Santa公司)，內(nèi)參-GAPDH抗體(美國Santa公司)，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標(biāo)記的兔抗羊二抗(南京金斯瑞生物科技有限公司),室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液(美國Millipore公司)進行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀(美國UVP公司)觀察蛋白條帶，對實驗結(jié)果進行灰度分析(ImageLab軟件)。

1.5免疫組織化學(xué)取出液氮保存的移植瘤組織，采用免疫組化SP法進行檢測，所有樣本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片；經(jīng)二甲苯脫蠟，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，98℃的枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH6.0)中浸泡15 min進行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加MIF和VEGF一抗工作液(美國Abcam公司)，37℃孵育2 h，PBS洗滌3×5 min，滴加生物素二抗(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，室溫孵育30 min，PBS洗滌3×5 min，DAB顯色(武漢博士德生物工程有限公司)，充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。若細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒則認為MIF或VEGF蛋白陽性，隨機選取10個含有陽性細胞的400倍視野進行觀察。用 Image-ProPlus 計算MIF和VEGF蛋白累積光密度(IOD)。

2　結(jié)　果

2.1各組裸鼠體重、移植瘤體積及瘤重的變化藥物治療15 d后，與陰性對照組相比，順鉑組裸鼠體重顯著降低(P<0.05)，而姜黃素低、中、高劑量組與陰性對照組之間的裸鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。順鉑組和姜黃素低、中、高劑量組的移植瘤體積均顯著小于陰性對照組(P<0.05)。姜黃素低劑量組移植瘤體積與順鉑組、姜黃素中、高劑量組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。順鉑組移植瘤瘤重明顯小于陰性對照組(P<0.05)，而姜黃素低、中、高劑量組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同劑量姜黃素組抑瘤率兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　各組裸鼠體重、移植瘤體積、瘤重的變化

與陰性對照組相比:1)P<0.05；與姜黃素低劑量組相比:2)P<0.05；與姜黃素中劑量組比較:3)P<0.05，下表同

2.2各組MIF、VEGF mRNA表達水平的變化順鉑組、姜黃素低、中、高劑量組MIF mRNA和VEGF mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組(P<0.05)；MIF mRNA相對表達量在姜黃素低、中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素低劑量組的VEGF mRNA相對表達量與姜黃素中、高劑量組及順鉑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3各組MIF、VEGF蛋白表達水平的變化順鉑組、姜黃素低、中、高劑量組的移植瘤組織中MIF、VEGF蛋白相對表達量明顯低于陰性對照組(P<0.05)。MIF蛋白相對表達量在姜黃素低、中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素低劑量組的VEGF蛋白相對表達量與姜黃素中、高劑量組及順鉑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3　各組MIF、VEGF mRNA表達水平的變化

表4　各組MIF、VEGF蛋白的IOD值

3　討　論

中藥姜黃的干燥根莖，具有清心解郁、活血止痛、行氣破淤等功效，臨床上廣泛用于治療跌打腫痛、腹痛、胃炎等，姜黃素是其主要化學(xué)成分，一種天然的多酚類化合物，具有色澤穩(wěn)定、毒性極低等特點，被廣泛應(yīng)用在食品添加劑和染料等領(lǐng)域〔5〕。此外，姜黃素還具有抗氧化、抗炎、預(yù)防血栓、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等多種作用〔6～8〕。多項隨機對照試驗已經(jīng)證實，姜黃素在人類疾病的治療中具有很高的安全性和有效性〔9〕。Lev-Ari等〔10〕的動物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理人非小細胞肺癌裸鼠移植瘤后，能夠顯著減緩移植瘤的生長速度，并且延長移植瘤小鼠的生存時間。Ferreira等〔11〕發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制乳腺癌細胞移植瘤的體內(nèi)生長及移植瘤內(nèi)的血管生成。本研究結(jié)果提示姜黃素對宮頸癌移植瘤生長有抑制作用，且姜黃素劑量越大抑瘤效果越強。并且在用藥期間，順鉑組小鼠逐漸出現(xiàn)活動減少，厭食，皮膚干澀，消瘦等表現(xiàn)。而其余各組沒有出現(xiàn)行動遲緩、消瘦、食欲降低、體表溫度下降等不良反應(yīng)，說明姜黃素?zé)o毒副作用，具有較好的安全性。姜黃素參與并影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)與步驟，如姜黃素能夠降低胃癌細胞裸鼠移植瘤組織中的淋巴管密度〔12〕、能夠增加肺癌細胞對化療敏感性〔13〕、對乳腺癌細胞具有抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用〔14〕。在惡性腫瘤進展過程中，腫瘤微環(huán)境中的炎性細胞具有重要的作用，由腫瘤細胞和基質(zhì)分泌的趨化因子、細胞因子和生長因子促進了腫瘤相關(guān)巨噬細胞的浸潤，進而刺激晚期癌癥細胞血管形成和侵襲〔15〕。MIF是一種能夠抑制離體巨噬細胞遷移的細胞因子，由活化T細胞分泌。Wang等〔16〕的研究證實，在宮頸癌細胞中，沉默MIF基因表達后，能夠抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力。淋巴管生成是腫瘤細胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，VEGF是最早被證實的能夠促進淋巴管生成的細胞因子。Sun等〔17〕的Meta分析結(jié)果顯示，VEGF陽性表達增加了宮頸癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險。Thacker等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過下調(diào)TGF-β信號通路活性，抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果提示姜黃素能夠有效地降低瘤組織中MIF和VEGF表達，這可能是姜黃素抗宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制。

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