吳正雙，林顯活，梁熾瓊,石英

(1.佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東 佛山　528225；2.佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 佛山　528000；3.天津工業(yè)大學(xué) 管理學(xué)院,天津　300387)

羅丹明B(又稱玫瑰紅B或堿性玫瑰精)和羅丹明6G(又稱玫瑰紅6G或羅丹明590)屬于鄰苯二酚類化合物，具有熒光染色的作用，在農(nóng)業(yè)、橡膠、染料、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1-3]。研究表明：羅丹明B和6G可能會(huì)引起誘變或致畸，對(duì)人體造成急性和慢性中毒傷害[4-6]。2008年，我國衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》(第一批)，將羅丹明B列入非食用物質(zhì)名單[7]。但由于其具有色澤鮮艷、著色穩(wěn)定、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，被大量非法用于食品的生產(chǎn)和加工，特別是被用于火鍋食品和其他調(diào)味品的染色。

目前，食品中羅丹明B和羅丹明6G的相關(guān)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)有SN/T 2430-2010《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》和NY/T 2656-2014《飼料中羅丹明B和羅丹明6G的測(cè)定 高效液相色譜法》。前者包括高效液相色譜-熒光法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，兩種方法的前處理過程均比較復(fù)雜繁瑣，需要經(jīng)凝膠滲透色譜凈化系統(tǒng)凈化，且檢測(cè)限均為5 μg/kg；后者為高效液相色譜-熒光法，定量限為1 μg/kg，雖然前處理比較簡(jiǎn)單，但是該方法只能通過保留時(shí)間定性，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。近年來火鍋食品中羅丹明B和羅丹明6G的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜-熒光法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。高效液相色譜-熒光法雖然應(yīng)用廣泛，但是由于熒光檢測(cè)器只能靠保留時(shí)間定性，對(duì)于基質(zhì)比較復(fù)雜的火鍋食品難免不能保證準(zhǔn)確性；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，特異性強(qiáng)，適用于復(fù)雜基質(zhì)中羅丹明B和羅丹明6G的測(cè)定，但是前處理凈化方法各異，因此探索一種簡(jiǎn)單、省時(shí)、節(jié)省溶劑、凈化效果好和回收率高的前處理方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取柱凈化樣品，經(jīng)LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定，建立了同時(shí)測(cè)定火鍋食品中羅丹明B和羅丹明6G的方法，該方法操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度和準(zhǔn)確度高，適用于定性和定量測(cè)定。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

羅丹明B(Rhodamine B，98.6%)、羅丹明6G(Rhodamine 6G，98.5%)：均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

乙腈、甲醇、甲酸：均為色譜純，德國Merck公司。

陽離子交換固相萃取柱(3 mL，60 mg)，MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱(3 mL，60 mg)，使用前均依次用3 mL甲醇和3 mL水活化；C18固相萃取小柱(3 mL，200 mg)，使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化；QuEChERS凈化小管(填料為無水硫酸鎂、PSA和C18混合物)，均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

Quattro Premier XE超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)美國Waters公司；OA-SYS水浴氮吹儀美國Organomation公司；電子天平；漩渦式混合器；恒溫振蕩器；離心機(jī)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取羅丹明B和羅丹明6G各5.0 mg，用乙腈溶解并定容至25 mL容量瓶中，均配制成200 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，根?jù)需要用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。

1.3.2樣品提取

少油型：稱取試樣1 ～2 g(精確至0.01 g)至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min(超聲過程中可不時(shí)振搖)，渦旋混勻，8000 r/min離心5 min，過濾，濾液待凈化。

多油型：稱取試樣1 g(精確至0.01 g)至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min(超聲過程中可不時(shí)振搖)，渦旋混勻，8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋1 min，棄去上層液，過濾，濾液待凈化。

1.3.3凈化

將上述濾液上固相萃取小柱，待其自然流盡后，依次用2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL甲醇洗滌小柱并壓干，最后用6 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，流速控制在1 mL/min。洗脫液在50 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1 mL 50%乙腈溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm濾膜過濾作為測(cè)定液，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.4液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　UPLC梯度洗脫程序Table 1 UPLC gradient elution procedures

1.3.5質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧正離子(ESI+)模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣流：N2，流速600 L/h；錐孔氣流：N2，流速50 L/h；碰撞氣：氬氣，流速0.12 mL/min。

2　結(jié)果與分析

2.1　質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取濃度為0.5 μg/mL的羅丹明B和羅丹明6G單標(biāo)溶液，采用注射泵直接進(jìn)樣的方式，在正離子模式下分別得到其母離子和特征子離子(見圖1)，并對(duì)透鏡電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳質(zhì)譜參數(shù)，見表2。

圖1　羅丹明B(a)和羅丹明6G(b)二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS secondary mass spectrogram of Rhodamine B (a) and Rhodamine 6G (b)

表2　羅丹明B和羅丹明6G的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of Rhodamine B and Rhodamine 6G in MRM mode

注：*表示定量離子。

2.2　色譜條件的優(yōu)化

分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水流動(dòng)相體系對(duì)羅丹明B和羅丹明6G的分離效果和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明：甲醇-水和乙腈-水分別為流動(dòng)相時(shí)，兩種目標(biāo)物的響應(yīng)都比較小，且峰形也不夠?qū)ΨQ。甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水分別為流動(dòng)相時(shí)，峰形明顯改善，且響應(yīng)也增強(qiáng)，但由于羅丹明B和6G為同分異構(gòu)體，極性相近，甲醇-0.1%甲酸水作流動(dòng)相，二者保留時(shí)間重疊(見圖2中a)，而乙腈-0.1%甲酸水可將二者有效分離(見圖2中b)，雖然質(zhì)譜檢測(cè)不受保留時(shí)間的限制，但是乙腈的洗脫效果高于甲醇，不僅可以節(jié)省溶劑，而且本實(shí)驗(yàn)顯示乙腈為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的響應(yīng)值也高。因此選用乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相。

a. 甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相

b.乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相圖2　羅丹明B和羅丹明6G的總離子流圖和MRM圖Fig.2 TIC and MRM chromatograms of Rhodamine B and Rhodamine 6G

2.3　提取溶劑的選擇

雖然羅丹明B和6G的極性比較弱，脂溶性強(qiáng)，按照相似相溶的原理，應(yīng)該用非極性溶劑提取，但同時(shí)二者又易溶于水、甲醇、乙腈、乙醇等常用溶劑。有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)顯示[12]，羅丹明B用乙酸乙酯-環(huán)己烷或正己烷提取，經(jīng)凝膠滲透色譜系統(tǒng)凈化，實(shí)驗(yàn)浪費(fèi)大量有機(jī)試劑，且檢出限比較高，不能滿足快速省時(shí)和高靈敏度的要求。本實(shí)驗(yàn)采用比較節(jié)省有機(jī)溶劑的甲醇和乙腈作為提取溶劑，并比較了兩者的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇在提取出目標(biāo)物質(zhì)的同時(shí)也提取出更多的極性雜質(zhì)，不但影響凈化效果也導(dǎo)致回收率下降；乙腈極性中等，采用乙腈提取，凈化后的樣液較為干凈，且回收率也高。故實(shí)驗(yàn)室采用乙腈為提取溶劑。

2.4　凈化條件的選擇

因?yàn)榛疱伿称分幸话愫写罅康挠椭蜕氐却蠓肿游镔|(zhì)和雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)隨著目標(biāo)物的提取一并提取出來，對(duì)色譜柱和質(zhì)譜離子源損傷較大，因此很有必要對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。羅丹明B和6G均為鄰苯二酚類化合物，屬于弱陰離子型化合物，可以用強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱凈化，同時(shí)也是弱極性化合物，也可以用反相的C18固相萃取柱凈化，因此本實(shí)驗(yàn)比較了陽離子交換固相萃取柱、C18固相萃取柱、混合型陽離子交換固相萃取柱、商品化的QuEChERS凈化小管(填料為無水硫酸鎂、PSA和C18混合物)4種方法的凈化效果，以回收率評(píng)價(jià)其凈化效果。

結(jié)果顯示：強(qiáng)陽離子交換柱和C18固相萃取柱都有一定的凈化效果，強(qiáng)陽離子交換柱對(duì)少油型的火鍋食品的凈化效果優(yōu)于C18，但對(duì)多油型的火鍋食品，C18的凈化效果優(yōu)于強(qiáng)陽離子交換柱?；旌闲完栯x子交換柱是反相和強(qiáng)陽離子交換的復(fù)合模式，對(duì)少油型和多油型的樣品凈化效果均比較好。商品化的QuEChERS凈化小管使用方便，但是回收率比較低，凈化效果不太理想。故本實(shí)驗(yàn)選用混合型陽離子交換柱凈化樣品。

2.5　方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍和檢出限

按照相應(yīng)的儀器工作條件，將1.3.1方法中配制好的羅丹明B和羅丹明6G混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣上機(jī)測(cè)定，以濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程見表3。

表3　羅丹明B和羅丹明6G的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and LODs of Rhodamine B and Rhodamine 6G

根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)對(duì)檢出限的定義，本實(shí)驗(yàn)以空白火鍋食品添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使羅丹明B和羅丹明6G的濃度水平均為0.5 μg/kg，按照1.3中的方法均平行測(cè)定8次，分別計(jì)算出8次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作檢出限(置信水平P=95%)[13]，得到這2種水平的檢出限分別為0.064，0.087 μg/kg。然后，按照1.3中的方法驗(yàn)證，結(jié)果顯示：羅丹明B和羅丹明6G添加濃度分別為0.064，0.087 μg/kg時(shí)，在UPLC-MS/MS仍然有響應(yīng)，且信噪比S/N>3，考慮到取整數(shù)，故確定二者的檢出限均為0.1 μg/kg。

2.5.2回收率和精密度

按照實(shí)驗(yàn)測(cè)定步驟，采用辣椒粉、火鍋油底料空白樣品，分別添加高、中、低3個(gè)濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，考察方法精密度，結(jié)果見表4。

表4　羅丹明B和羅丹明6G加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of Rhodamine B and Rhodamine 6G (n=6)

由表4可知，在不同加標(biāo)濃度條件下，不同的樣品中，2種化合物的加標(biāo)回收率為81.6%～101.1%，精密度范圍(RSD)為4.2%～10.4%，能夠滿足日常檢測(cè)工作的需要。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以火鍋食品為研究對(duì)象，采用乙腈提取，MCX混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定其中可能違法添加的羅丹明B和羅丹明6G。方法前處理過程簡(jiǎn)單、快捷、節(jié)省試劑；混合型陽離子交換固相萃取柱凈化效果好，回收率高，為81.6%～101.1%，精密度(RSD)為4.2%～10.4%；檢出限低，羅丹明B和羅丹明6G均為0.1 μg/kg。 該方法適用于少油型和多油型火鍋食品的檢測(cè)，可同時(shí)定性和定量測(cè)定其中的羅丹明B和羅丹明6G，能夠滿足日常檢測(cè)工作的要求。

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