張　樂，劉　超，翁麗萍

(杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州　310024)

目前，隨著人們生活水平的提高，對各類水產品的消費量日益增大，但水產養(yǎng)殖及運輸?shù)冗^程中違規(guī)用藥的事情層出不窮，且使用的藥物種類繁多，這些獸藥的濫用亂用給消費者健康帶來了極大地隱患。目前已報道的水產品中藥物殘留主要有磺胺類[1-4]、喹諾酮類[5-10]、四環(huán)素類[11-14]、硝基咪唑類[15]、大環(huán)內酯類[16-17]等抗生素，以及激素類[18-21]等藥物。

目前水產品中抗生素及激素類藥物殘留監(jiān)測主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫及膠體金法等，但抗生素類及激素類藥物種類繁多，僅抗生素臨床使用的就近千種，若想篩查出影響質量安全的具體藥物，需要投入巨大的人力物力進行一系列檢測試驗，成本巨大且周期很長。

高分辨篩查技術可提供質量范圍內目標物的精確質量數(shù)，具有選擇性高、受干擾小、掃描速度快等特點，而在藥物篩查方面受到越來越多的關注。張曉光等[22]利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜快速篩查保健品中23種非法添加西藥成分。嚴鳳等[23]利用超高效液相色譜一四級桿一靜電場軌道阱高分辨質譜篩查測定飼料中19種磺胺類藥物，但利用靜電場軌道阱高分辨質譜高通量篩查水產品藥物殘留國內未見報道。

本研究通過建立Q-E質譜篩查信息庫，并建立超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜篩查水產品中62種藥物殘留的方法，達到快速準確篩查的目的。

1　材料與方法

1.1　儀器和試劑

儀器有Q-Exactive超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(美國ThermoFisher公司)，MS204電子天平(瑞士梅特勒公司)，Eppendorf5810R離心機(德國Eppendorf公司)，氮吹儀(OrganomationN- EVAP-24)，Hei-VAPPrecision全自動旋轉蒸發(fā)儀(德國，海道爾夫)。

標準品：萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、西諾沙星、吡哌酸、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟羅沙星、加替沙星、沙拉沙星、司帕沙星、雙氟沙星、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、甲氧芐啶磺胺喹惡啉、磺胺多辛、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡啶、土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素、美他環(huán)素、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奧硝唑、克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素、紅霉素、羅紅霉素、甲基睪酮、炔諾酮、醋酸氯地孕酮、左炔諾孕酮、利福平、氨芐西林、頭孢拉定(德國Dr．Ehrenstofer公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2　標準溶液的配置

準確稱取上述標準品12.5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，得到濃度為500 μg·mL-1的單標準儲備液，置于-18 ℃冷凍保存。使用時用30%乙腈溶液稀釋至所需濃度的單標或混標。

1.3　樣品前處理

5 g樣品，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，超聲5 min，渦旋1 min，4 000 r·min-1離心10 min，取出上清液，殘渣再用10 mL0.1%甲酸乙腈提取1次，合并提取液35 ℃旋轉蒸發(fā)干，2 mL溶解液溶解，過0.2 μm濾膜，上機測定。

1.4　儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：AcquityUPLCBEHC18，2.1 mm×150 mm，1.7 μm。流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸+2 mmol甲酸銨；梯度洗脫，洗脫程序：0～2 min，5%A；2～8 min，5%～30%A；8～15 min，30%～95%A；15～17 min，95%A；17～20 min，5%A；流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量5 μL。

1.4.2質譜條件

正離子掃描，分辨率70 000，毛細管電壓3.2 KV，離子傳輸管溫度320 ℃，氣化溫度350 ℃，鞘氣壓40 arb，輔助氣壓10 arb，一級質譜駐留時間100 ms，二級質譜駐留時間50 ms，一級全掃描范圍m/z60～850，掃描模式Funscan+ddms(一級全掃描+自動觸發(fā)二級質譜掃描)，碰撞能量為(40±60)% eV。

2　結果與分析

2.1　篩查數(shù)據(jù)庫的建立

取合適濃度的標準品溶液，在上述質譜條件下進行掃描，得到目標物的準確荷質比，然后進行二級質譜掃描，得到目標物的二級質譜掃描圖和離子碎片信息，最后在優(yōu)化的色譜條件下進樣，得到目標物的保留時間信息，根據(jù)上述信息建立62種藥物的篩查信息數(shù)據(jù)庫(表1)。

對比一級母離子的理論和實測結果的m/z，偏差范圍在0.02～1.74×10-6，符合高分辨質譜定性的質量準確度誤差5×10-6以內的要求。

2.2　樣品提取與色譜條件的選擇

樣品提取液測試了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸甲醇等幾種，通過添加回收比對，選取0.1%甲酸乙腈作為提取劑。

在色譜條件方面，測試了不同色譜柱(HypersilGold C182.1 mm×100 mm，1.7 μm；ACQUITYUPLCHSST 32.1 mm×100 mm，1.7 μm；ACQUITYUPLCBEHC18 2.1 mm×150 mm，1.7 μm)、不同流動相(乙腈-0.1%甲酸體系；乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1甲酸銨體系)及不同流動相梯度的情況。T3柱分離喹諾酮類藥物峰形拖尾，其他幾種條件對大部分物質分離良好，但幾組同分異構體分不開，最后通過測試選擇1.4.1的條件。上述條件下，目標物響應良好(圖1)，各組同分異構體分離度和峰形均達到較滿意的結果，見m/z=311.1同分異構體磺胺多辛和磺胺間二甲氧嘧啶(圖2),m/z=281.1同分異構體磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺6-甲氧嘧啶和磺胺甲氧噠嗪(圖3)，m/z=445.2同分異構體四環(huán)素和強力霉素(圖4)。

圖1　全掃描的結果

圖2　m/z=311.1同分異構體的色譜

表1　藥物篩查的信息

圖3　m/z=281.1同分異構體的色譜

圖4　m/z=445.2同分異構體的色譜

2.3　檢出限與回收率

根據(jù)檢測限信噪比>3，定量限信噪比>10的要求，確定本方法的檢出限10 μg·kg-1。在淡水魚、甲魚兩種基質中分別添加20、200 μg·kg-1濃度水平的混合標準溶液進行回收實驗，回收率范圍在48.3%～105.8%。部分藥物回收率偏低，可能因為基質效應，以及前處理方式還有改進空間，但本研究作為一個高通量的快速篩查方法，主要是定性的準確性，定量可通過后續(xù)三重四極桿液質進一步驗證確認。

2.4　實際樣品檢測

應用本研究建立的方法檢測篩查了12批次水產樣品，其中一批次淡水魚樣品篩查出恩諾沙星，結果與三重四級桿液質檢測結果接近。

3　小結

本研究建立了超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜篩查水產品中藥物殘留的方法，在20 min的內完成62種藥物的篩查確證。方法具有質量精度高、前處理簡單、快速的特點，達到快速高通量準確篩查水產品藥物殘留的目的。

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