李 鵬 ，田 嘉 ，張 琦 ，董勝利 ，章世奎 ，李 疆

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 輪臺果樹資源圃，新疆 輪臺 841600）

栽培扁桃在我國主要分布在新疆喀什地區(qū)莎車縣、英吉沙縣及其周邊地區(qū)[1]，2014年栽培面積約7.5萬hm2，結(jié)果面積約4萬hm2，盛果面積約1.3萬hm2，總產(chǎn)量約4萬t[2]，已成為南疆振興地方經(jīng)濟和少數(shù)民族農(nóng)民脫貧致富的重要組成部分[3]。但新疆扁桃單株產(chǎn)量較低，僅是美國加州扁桃單株產(chǎn)量的1/10～1/5[1]，尤其是近年來新疆頻繁出現(xiàn)的極端低溫天氣嚴(yán)重影響了扁桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。所以，很有必要探明中國當(dāng)?shù)卦耘啾馓移贩N、國外引進(jìn)扁桃品種抗寒性及低溫下生理生化指標(biāo)變化，如糖類物質(zhì)[5]、脯氨酸、丙二醛等抗寒相關(guān)物質(zhì)含量變化[6]，SOD、POD等相關(guān)酶活性變化[7]，SIZ1、ICE1、CBF/DREB1、WRKY21、HOS1、ANK等抗寒相關(guān)基因表達(dá)量變化[8-9]。由于扁桃樹體較大，童期較長，不易在大田中進(jìn)行低溫脅迫試驗，只能在實驗室內(nèi)模擬自然低溫對扁桃離體枝條進(jìn)行低溫處理，所以很有必要篩選出適宜扁桃離體枝條培養(yǎng)的最佳方式。李鵬等人[3]剪取處于露紅期的扁桃枝條，帶回實驗室后水培在1/2MS+20 g/L蔗糖培養(yǎng)液中，能較好地進(jìn)行花蕾抗寒性試驗。Mousavi S等剪取處于大蕾期的扁桃枝條，水培在5%蔗糖溶液中，經(jīng)低溫處理后，對耐寒型（H型）以及冷敏感型（Sh12型）扁桃花藥、子房進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析[10]和miRNAs差異表達(dá)分析[11]。但以上2種扁桃離體枝條培養(yǎng)方法適用于春季扁桃枝條的短期培養(yǎng)，對休眠期扁桃枝條培養(yǎng)效果不佳，不能滿足休眠期扁桃抗寒試驗的需要。本試驗剪取新疆主栽扁桃品種‘紙皮’休眠期枝條，通過在智能人工氣候箱內(nèi)用1/2MS+5%蔗糖溶液水培、培養(yǎng)土扦插和花泥固定1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)的方法，觀測扁桃花芽、葉芽生長情況，比較不同培養(yǎng)方式下‘紙皮’扁桃休眠期離體枝條的生長情況，篩選出適宜‘紙皮’扁桃休眠期離體枝條培養(yǎng)的最佳方式，為全面開展扁桃抗寒分子生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃30年生‘紙皮’扁桃樹為試驗材料，于2017年1月1日剪取‘紙皮’扁桃1年生枝條90枝，用凡士林涂抹剪口，帶回實驗室后將枝條下端剪成斜口，長20 cm，并剝掉枝條下端5 cm內(nèi)的芽。先將枝條下端浸泡在5 cm深的75%酒精中40～60 s，再浸泡在5 cm深的0.10%氯化汞中8～10 min，然后用清水沖洗干凈，4 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 扁桃枝條培養(yǎng)方法

（1）1/2MS+5%蔗糖溶液水培

用無菌水配制1/2MS+5%蔗糖溶液，倒入燒杯中，深5 cm，然后將處理好的枝條插入培養(yǎng)液中。3組重復(fù)，每組10個枝條。

（2）培養(yǎng)土扦插

將泥炭土和蛭石按照2∶1體積比充分混合，80 ℃烘箱滅菌3 d，無菌水澆透，然后將處理好的枝條插入培養(yǎng)土中，深5 cm。3組重復(fù)，每組10個枝條。

（3）花泥固定1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)

先把花泥（20 cm×10 cm×7 cm，不含保鮮劑）放入1/2MS+5%蔗糖溶液中吸滿培養(yǎng)液，然后將處理好的枝條插入花泥中，深5 cm，再加入1/2MS+5%蔗糖溶液使花泥外的培養(yǎng)液深2 cm。3組重復(fù)，每組10個枝條。

（4）大田自然生長

以新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺果樹資源圃自然生長‘紙皮’扁桃樹上的枝條為對照，在東南西北4個方向上均勻選取30個1年生枝條進(jìn)行試驗。

1.2.2 智能人工氣候箱的設(shè)置

用智能人工氣候箱（型號RXZ-250B），模擬扁桃生長地氣候變化設(shè)置4個培養(yǎng)階段，每天設(shè)置為4個時間段，第1時間段和第3時間段空氣濕度設(shè)置為50%，第2時間段設(shè)置為35%，第4時間段設(shè)置為70%。每個時間段具體時長、溫度和光照設(shè)置如下：

（1）第一培養(yǎng)階段5 d

第1時間段設(shè)置為5 h、10 ℃、6000 lx；第2時間段設(shè)置為3 h、13 ℃、8000 lx；第3時間段設(shè)置為5 h、10 ℃、6000 lx；第4時間段設(shè)置為11 h、5 ℃、0 lx。

（2）第二培養(yǎng)階段5 d

第1時間段設(shè)置為5 h、15 ℃、8000 lx；第2時間段設(shè)置為3 h、18 ℃、10000 lx；第3時間段設(shè)置為5 h、15 ℃、8000 lx；第4時間段設(shè)置為11 h、8 ℃、0 lx。

（3）第三培養(yǎng)階段10 d

第1時間段設(shè)置為5 h、20℃、10000 lx；第2時間段設(shè)置為3 h、23℃、11000 lx；第3時間段設(shè)置為5 h、20℃、10000 lx；第4時間段設(shè)置為 11 h、11℃、0 lx。

（4）第四培養(yǎng)階段10 d

第1時間段設(shè)置為“5 h、23℃、11000 lx”；第2時間段設(shè)置為“3 h、25℃、12000 lx”；第3時間段設(shè)置為“5 h、23℃、11000 lx”；第4時間段設(shè)置為“11 h、14℃、0 lx”。

1.3 數(shù)據(jù)測量和統(tǒng)計分析

在智能人工氣候箱培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計‘紙皮’扁桃的葉芽、花芽指標(biāo)，并在盛花期（2017年4月5日）統(tǒng)計在大田自然生長的‘紙皮’扁桃的葉芽、花芽指標(biāo)。統(tǒng)計花芽生長指標(biāo)時選取1年生枝條上部10個花芽，每組100個花芽， 3組重復(fù)。統(tǒng)計葉芽生長指標(biāo)時選取1年生枝條頂部葉芽，每組10個葉芽，3組重復(fù)。

用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（型號DL91150）測量花瓣縱徑、花瓣橫徑、花絲長度、雌蕊長度、葉片縱徑和葉片橫徑，用分析天平（型號AL204-IC）稱量單花質(zhì)量、花瓣質(zhì)量、花藥質(zhì)量、雌蕊質(zhì)量和葉芽質(zhì)量。

1.3.1 花粉量的測定

在盛花期收集已綻放花朵未散粉花藥10粒于1.5 mL離心管中，將離心管敞口、直立置于密閉小盆中，于30 ℃烘箱中散粉24 h。取出離心管，用微量移液槍加入含有0.5%番紅的50%酒精溶液200 μL，再加入800 μL蒸餾水，旋渦混合器震蕩3 min，轉(zhuǎn)速為650 r/min，迅速吸取溶液中部10 μL花粉懸浮液，滴于載玻片上（7～9滴），顯微鏡下統(tǒng)計花粉量a，則單花藥花粉量近似為10×a，10組重復(fù)。

1.3.2 花粉活力的測定

在盛花期采摘剛散粉花藥，用棉簽將花粉均勻地播種在含有1%瓊脂粉、5%蔗糖、0.01%硼酸的花粉培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)4 h后在顯微鏡下統(tǒng)計1000個花粉粒的萌發(fā)情況，計算出花粉活力[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 20.0單因素方差Duncan法檢測差異顯著性。將所測各指標(biāo)看作單一變量，假設(shè)葉芽和花芽生長情況在評估枝條生長情況中所占比重相同、芽成活率和生長情況所占比重相同，則葉芽、花芽和枝條的相對生長值計算公式如下：

式中：n代表葉芽或花芽所測的指標(biāo)數(shù)；i代表所測葉芽或花芽指標(biāo)的編號，i=1，2，…，n；Ti指葉芽或花芽i指標(biāo)的相對生長值；imax指大田自然生長葉芽或花芽的i指標(biāo)；SL指葉芽成活率；SF指花芽成活率；UL指葉芽的相對生長值；UF指花芽的相對生長值；UB指枝條的相對生長值。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體培養(yǎng)扁桃枝條的花芽生長情況

以自然生長的‘紙皮’扁桃花芽為對照，比較3種離體培養(yǎng)方式下扁桃花芽的生長情況。由表1可知，在1/2MS+5%蔗糖溶液水培條件下，花芽成活率僅有8.33%，大部分花芽枯死；花芽質(zhì)量最小，為0.127 g，生長較差，花瓣較小，不能完全綻放；花藥發(fā)育差，單花藥花粉量僅是自然生長的1/2左右，花粉活力最低，花絲較短，僅65.67%花絲能正常伸展；雌蕊較短，質(zhì)量較小，僅46.67%的柱頭高于花藥；花芽的相對生長值為35.44%，發(fā)育情況最差（見圖1-E），不能滿足試驗需要。

在培養(yǎng)土扦插條件下花芽成活率為27.67%，花芽質(zhì)量為0.174 g，花瓣較小，少部分能完全綻放；花藥發(fā)育差，單花藥花粉量約是自然生長的2/3，花粉活力較低，花絲短，84.67%的花絲能正常伸展；雌蕊短，質(zhì)量一般，55.33%的柱頭高于花藥；花芽的相對生長值為52.47%，發(fā)育情況一般（見圖1-I），也不能滿足試驗需要。

表1 離體培養(yǎng)扁桃枝條的生長情況?Table 1 The growth of almond branches in vitro culture

花泥固定1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)枝條的花芽成活率較高，為83.33%，花芽質(zhì)量達(dá)到了0.24 g，花瓣較大，大部分能完全綻放；花藥發(fā)育較好，花粉量是自然生長的3/4左右，花粉活力較高，花絲較長，92.33%能正常伸展；雌蕊較長，74.67%的柱頭高于花藥?；ㄑ肯鄬ιL值為85.87%，發(fā)育情況較好（見圖1-M），接近大田自然生長的枝條（見圖1-Q），可用于進(jìn)行休眠期‘紙皮’扁桃花芽相關(guān)試驗。

2.2 離體培養(yǎng)扁桃枝條的葉芽生長情況

扁桃枝條離體培養(yǎng)條件下葉芽生長情況和花芽生長情況基本相同。由表1可知，1/2MS+5%蔗糖溶液水培條件下葉芽成活率僅為33.33%，葉芽質(zhì)量最小，為0.043 g；葉片縱徑和葉片橫徑也最小，葉芽相對生長值最低，為36.86%，葉芽發(fā)育情況最差（見圖1-E），不能滿足試驗需要。培養(yǎng)土扦插條件下葉芽成活率為56.67%，葉芽質(zhì)量較小，為0.086 g，葉片縱徑和葉片葉片橫徑也較小（見圖1-I），葉芽相對生長值為58.86%，葉芽發(fā)育情況一般?；喙潭?/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)條件下葉芽成活率為86.67%，葉芽質(zhì)量較高，葉片縱徑和葉片橫徑也較大（見圖1-M），葉芽相對生長值最高，為88.96%，發(fā)育情況最好，最接近大田自然生長的枝條（見圖1-Q），可用于進(jìn)行休眠期‘紙皮’扁桃離體枝條葉芽相關(guān)試驗。

圖1 離體培養(yǎng)的‘紙皮’扁桃枝條生長過程Fig.1 The growth process of ‘Zhipi’ almond branches in vitro culture

2.3 離體培養(yǎng)扁桃的枝條生長情況

由表1可知，1/2MS+5%蔗糖溶液水培條件下，枝條相對生長值為36.15%，枝條生長情況最差（見圖1-E）；培養(yǎng)土扦插條件下，枝條相對生長值為55.66%，枝條生長情況一般（見圖1-I）；花泥固定1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)條件下，枝條相對生長值為87.41%，枝條生長情況較好（圖1-M），最接近大田自然生長的枝條（圖1-Q），可用于進(jìn)行‘紙皮’扁桃休眠期抗寒相關(guān)試驗。

3 討 論

‘紙皮’扁桃枝條離體培養(yǎng)條件下需要進(jìn)行滅菌處理，未滅菌處理的‘紙皮’扁桃枝條經(jīng)3種培養(yǎng)方式培養(yǎng)均易被細(xì)菌、真菌感染。當(dāng)溫度高于18 ℃時，1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)的枝條會長出大量細(xì)菌、真菌，2 d后培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，3 d后培養(yǎng)液中會出現(xiàn)絮狀真菌和黃色菌斑，5 d后培養(yǎng)液中會出現(xiàn)大量絮狀真菌，表面會出現(xiàn)黑色菌塊；花泥固定1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)枝條上的細(xì)菌、真菌生長稍慢；培養(yǎng)土扦插枝條上的細(xì)菌、真菌生長最慢。1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)枝條前，用75%酒精浸泡枝條下部40～60 s，能減緩細(xì)菌、真菌生長，但效果不佳；用75%酒精浸泡枝條下部40～60 s，再用0.10%升汞浸泡10～12 min[13]，可有效控制細(xì)菌、真菌生長。

光照[14]、溫度[15]、水分[16]都是扁桃離體枝條生長的重要因素。智能人工氣候箱的光是模擬太陽光設(shè)計，含有植物光合作用所需的光區(qū)，有助于葉芽和花芽進(jìn)行光合作用，也有助于殺死部分細(xì)菌、真菌。溫度對扁桃離體枝條生長也十分重要[16]，冬季花芽處于休眠期，生長較慢，隨著溫度的上升，花芽逐漸解除休眠，恢復(fù)生長，膨大并變成花朵[15]。所以，本試驗依據(jù)扁桃枝條采樣地的氣候變化，將智能人工氣候箱設(shè)置為4個逐漸升溫的培養(yǎng)階段，并將每天設(shè)置為4個時間段。水分是扁桃離體枝條光合作用、營養(yǎng)運輸?shù)闹匾獏⑴c者，大田條件下根壓可為扁桃花芽、葉芽發(fā)育提供足夠的水分，但離體培養(yǎng)條件下‘紙皮’扁桃枝條的水分供應(yīng)主要來自滲透調(diào)節(jié)，空氣濕度太小易導(dǎo)致芽失水過多，逐漸干枯，不能完全綻放；枝條出現(xiàn)栓塞，木質(zhì)部導(dǎo)水率降低，進(jìn)而影響枝條生長[16]?？諝鉂穸忍笥謺T發(fā)細(xì)菌、真菌大量繁殖，導(dǎo)致花芽、葉芽發(fā)霉并逐漸死亡。本試驗依據(jù)扁桃枝條采樣地的氣候變化，將智能人工氣候箱第1時間段和第3時間段空氣濕度設(shè)置為50%，第2時間段空氣濕度設(shè)置為35%，第4時間段空氣濕度設(shè)置為70%，即滿足了‘紙皮’扁桃離體枝條對水分的需求，又不會導(dǎo)致枝條花芽、葉芽發(fā)霉。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)‘紙皮’扁桃離體枝條超過25 cm時，不利于水分運輸，所以本試驗將枝條剪成20 cm長。本試驗?zāi)M‘紙皮’扁桃自然生長地的氣候條件，并結(jié)合‘紙皮’扁桃離體枝條生長的需要，來設(shè)置智能人工氣候箱，完全能滿足‘紙皮’扁桃離體枝條的生長需要。

本試驗1/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)條件下，‘紙皮’扁桃花芽、葉芽的成活率最低，發(fā)育情況最差，這可能是因為休眠期枝條培養(yǎng)到花期所需時間較長，1/2MS+5%蔗糖溶液中空氣含量少，不足以滿足‘紙皮’扁桃離體枝條生長需要，導(dǎo)致枝條生長不良，逐漸干枯死亡。培養(yǎng)土扦插條件下花芽和葉芽成活率一般，發(fā)育情況一般，葉芽比花芽發(fā)育情況稍好，可能是因為花芽比葉芽更敏感，培養(yǎng)土透氣透水性強，不能為花芽發(fā)育提供足夠的水分?；喙潭?/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)條件下，‘紙皮’扁桃花芽、葉芽成活率最高，發(fā)育情況較好，這可能和花泥持水量大、透氣性好，能為花芽和葉芽發(fā)育提供較多的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，有利于枝條生長有關(guān)。

4 結(jié) 論

1/2MS+5%蔗糖溶液水培條件下，花芽成活率僅有8.33%，相對生長值為35.44%；葉芽成活率僅為53.66%，葉芽相對生長值最低，為36.86%；枝條相對生長值為36.15%，‘紙皮’扁桃枝條生長情況最差，不適宜進(jìn)行休眠期扁桃枝條抗寒相關(guān)試驗。培養(yǎng)土扦插條件下，花芽成活率為27.67%，花芽相對生長值為52.47%；葉芽成活率為53.66%，葉芽相對生長值為58.86%；枝條相對生長值為55.66%，‘紙皮’扁桃枝條生長情況一般，不能滿足休眠期扁桃花芽抗寒相關(guān)試驗需要?；喙潭?/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)條件下，花芽成活率最高為83.33%，花芽相對生長值為85.87%；葉芽成活率為86.67%，葉芽相對生長值為88.96%；枝條相對生長值為87.41%；‘紙皮’扁桃枝條生長情況最好?；喙潭?/2MS+5%蔗糖溶液培養(yǎng)扁桃離體枝條的方法最好，可用于‘紙皮’扁桃休眠期抗寒試驗研究。

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