徐 新，李佳川，王 元，龍 怡

(1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院針灸學校，四川 成都 610075)

藤茶[1-3]是湖南武陵山區(qū)土家族常用的藥食保健資源，也是四川、湖北、貴州等地的彝族、苗族[4-5]少數(shù)民族習用飲品，具有悠久的應(yīng)用歷史、較高的營養(yǎng)成分和醫(yī)藥保健價值，開發(fā)價值很大.現(xiàn)代研究表明，藤茶富含豐富的多糖類、黃酮類以及多酚類化合物[6]，具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、調(diào)血脂[10-11]等多種藥理活性.近年來，隨著生活水平的提高，心腦血管疾病、代謝性疾病已成為嚴重危害人類健康的重大疾病，早期防治臨床意義顯著.諸多研究提示，氧化應(yīng)激損傷是諸多心腦血管疾病、代謝性疾病發(fā)生的共同病理生理基礎(chǔ)，這些疾病的發(fā)生與機體“過量”的氧化應(yīng)激發(fā)生呈正相關(guān).因此，本研究以武陵山區(qū)土家族常用的道地藥食資源藤茶為研究對象，在中醫(yī)藥及民族醫(yī)藥理論的指導下，分別建立DPPH自由基清除法、羥基自由基清除法、超氧陰離子清除法、總抗氧化能力測定法共4種體外抗氧化模型，系統(tǒng)觀察藤茶的體外抗氧化保健活性，以期為藤茶的合理使用和為進一步保健產(chǎn)品開發(fā)提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥物

野生藤茶，產(chǎn)地湖南省張家界，經(jīng)西南民族大學顧健教授鑒定為顯齒蛇葡萄科Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.wang的干燥嫩莖葉.采用水煎煮提取制備成1 g(原藥材)/mL濃度藥液，-20℃保存?zhèn)溆?抗壞血酸(Vc)，北京百靈威科技有限公司，批號:LDC0Q76.

1.2 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，sigma，批號:D9132；水楊酸，鎮(zhèn)江前進化工有限公司，批號:DS0122；抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20170328和20170329.

1.3 儀器

Multiskan Spectrum全波長酶標儀，Thermo Scientific；722N可見分光光度計，上海萊帕德科學儀器有限公司.

1.4 方法

1.4.1 DPPH自由基的清除率測定

參考Kumaran等[12]方法并稍作修改，分別精密吸取藤茶供試品溶液，置5 mL離心管中，加入無水乙醇補足至2 mL，搖勻.加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液溶液，搖勻，避光放置30 min，離心，取上清液于517 nm下測定吸光度值，每組平行測定三次，取平均值計算清除率，公式如下:

(式中A0為DPPH乙醇溶液的吸光度值，As為樣品溶液的吸光度值)

1.4.2 對羥基自由基的清除率的測定

參考彭金龍等[13]和蘇秀蘭[14]等方法并稍作修改，分別精密吸取1 mL藤茶供試品溶液，置5 mL離心管中，在離心管中分別加入1 mL 9 mmol/L的Fe-SO4溶液和1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，加入1 mL 30%H2O2啟動反應(yīng)，放入37℃水浴鍋恒溫反應(yīng)30 min，用待測液空白對照管作為空白對照，以Vc作為陽性對照.蒸餾水調(diào)零，用分光光度計測定波長為510 nm處的吸光度.每組平行測量三次，取均值.清除率公式如下:

(A1:被測液的吸光度；A0:被測液的空白對照；A2:水楊酸的空白對照)

1.4.3 超氧陰離子自由基(O2-·)清除法率的測定

依據(jù)預實驗結(jié)果制備藤茶相應(yīng)濃度供試品溶液，按照抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的要求，分別檢測藤茶對超氧陰離子自由基的影響.

1.4.4 總抗氧化能力的測定

依據(jù)預實驗結(jié)果制備藤茶相應(yīng)濃度供試品溶液，按照總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒的要求，制備FeSO4-7H2O標準品，以標準品OD值為橫坐標，各OD值對應(yīng)的標準品濃度為縱坐標制成標準曲線，得曲線公式，把樣本測定管測得的OD值代入計算公式，求得藤茶的總抗氧化能力.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，并計算相關(guān)數(shù)據(jù)的IC50值.

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶對DPPH自由基的清除作用

DPPH作為一種穩(wěn)定的有機自由基試劑，常被用作體外測定藥物的抗氧化活性篩選使用.本實驗研究結(jié)果如表1和圖1，隨著藤茶濃度的增加，藤茶對DPPH自由基的清除作用呈濃度依賴性的增加，其IC50值為 33.805 μg/mL，當濃度達到 190.6 μg/mL時，清除率達到90%以上.

表1 藤茶對DPPH自由基的清除作用(±s)Table 1 Scavenging effect of Vine tea on DPPH radical(±s)

表1 藤茶對DPPH自由基的清除作用(±s)Table 1 Scavenging effect of Vine tea on DPPH radical(±s)

組別 濃度(μg/mL) 樣本數(shù)(n) 清除率(%)藤茶提取物 238.3 3 91.3±2.4 190.6 3 90.9±2.3 152.5 3 89.5±3.1 122.0 3 87.4±2.1 97.6 3 83.7±2.2 78.1 3 79.1±2.5 62.5 3 72.3±2.1 50.0 3 65.2±1.5 40.0 3 55.3±1.6 32.0 3 46.1±1.1 25.6 3 39.1±1.2 20.5 3 32.1±1.8抗壞血酸 50.0 3 88.4±2.6 40.0 3 85.9±2.4 32.0 3 80.7±1.9 25.6 3 74.6±2.1 20.5 3 65.2±1.7

圖1 藤茶提取物清除DPPH自由基濃度-清除率曲線(量效關(guān)系)Fig 1 The concentration-clearance rate curve of Vine tea extractive’s scavenging on DPPH radical(dose-effect relationship)

2.2 藤茶對羥基自由基的清除作用

羥基自由基的清除率是反應(yīng)藥物抗氧化活性的臨床應(yīng)用重要指標，羥基自由基能與體內(nèi)多種物質(zhì)相互作用，導致細胞氧化損傷.本實驗研究結(jié)果如表2和圖2所示，藤茶在1.6～200 mg/mL范圍內(nèi)，對羥基自由基的消除率呈濃度依賴性的增加，其IC50值為18.713 mg/mL，當濃度達到150 mg/mL時，清除率達到90%以上.

表2 藤茶對羥基自由基的清除作用(±s)Table 2 Scavenging effect of vine tea on hydroxyl radicals(±s)

表2 藤茶對羥基自由基的清除作用(±s)Table 2 Scavenging effect of vine tea on hydroxyl radicals(±s)

組別 濃度(mg/mL) 樣本數(shù)(n) 清除率(%)藤茶提取物 200.0 3 95.5±3.2 150.0 3 91.7±2.4 100.0 3 86.7±2.6 80.0 3 81.4±2.2 50.0 3 73.1±1.8 25.0 3 56.3±1.7 12.5 3 37.5±1.2 6.3 3 22.2±0.9 3.2 3 13.5±1.2 1.6 3 8.8±0.8抗壞血酸 6.3 3 86.7±3.1 3.2 3 84.4±2.5 1.6 3 75.6±1.7 0.78 3 58.0±1.4 0.39 3 29.0±1.1

圖2 藤茶提取物清除羥基自由基濃度-清除率曲線(量效關(guān)系)Fig 2 The concentration-clearance rate curve of Vine tea extractive’s scavenging on hydroxyl radicals(dose-effect relationship)

2.3 藤茶對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子是活性氧的一種，過量會對機體造成嚴重損害.本實驗研究結(jié)果如表3和圖3，藤茶顯示出較好的抗超氧陰離子自由基的作用.藥物在1.6～200 mg/mL范圍內(nèi)，抗超氧陰離子自由基的活力值呈濃度依賴性的增加，當藤茶濃度達到200 mg/mL時，其活力值最高可達到263.1U/L.

表3 藤茶對超氧陰離子的清除作用(x-±s)Table 3 The scavenging effect of Vine tea on superoxide anion(x-±s)

圖3 藤茶清除超氧陰離子自由基濃度-活力值曲線(量效關(guān)系)Fig 3 The concentration-vitality value curve of Vine tea’s scavenging on superoxide anion radicals(dose-effect relationship)

2.4 藤茶總抗氧化能力(FRAP法)的測定

以FeSO4·7H2O標準品 OD值為橫坐標，各 OD值對應(yīng)的標準品濃度為縱坐標制成標準曲線，如圖4所示，用作圖軟件制得曲線公式為 y＝4.9958x-0.5785(R2＝0.999).將各濃度藤茶的測定OD值帶入曲線公式，即得表4，實驗研究結(jié)果如圖5所示，藤茶在0.195～6.30 mg/mL的濃度內(nèi)，總抗氧化能力變化幅度較小，但隨著劑量的增加，在12.50～50.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，藥物總抗氧化能力呈濃度依賴性的增加，最高值達到19.764 mM.

圖4 總抗氧化能力測定標準曲線Fig 4 The standard curve of total antioxidant capacity

表4 藤茶對總抗氧化能力的影響(x-±s)Table 4 Effect of vine tea on total antioxidant capacity(x-±s)

圖5 藤茶濃度-總抗氧化能力曲線(量效關(guān)系)Fig 5 The concentration-total antioxidant capacity curve of Vine tea(dose-effect relationship)

3 討論與結(jié)論

活性氧與自由基損傷對人體健康的影響深刻而廣泛，生物機體正常代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子、羥基自由基等多種活性氧自由基，這些過多的自由基是造成機體組織病理性損傷的病理基礎(chǔ).在正常情況下，機體的自由基處于正常的動態(tài)平衡，機體產(chǎn)生的過多自由基會迅速被體內(nèi)的清除劑所清除.但當機體的抗氧化防御體系受到損傷時，人體各系統(tǒng)的代謝發(fā)生紊亂，從而引發(fā)機體心腦血管疾病、代謝性疾病甚至腫瘤等一系列疾病的發(fā)生[15].尤其隨著生活水平的提高，長期的高血糖、高血脂的作用，加劇造成這一系列病理性的“過氧化”，通過氧化應(yīng)激加速損傷血管內(nèi)皮細胞，導致血管內(nèi)皮舒縮功能障礙或異常，導致血管壁動脈粥樣硬化版塊形成，從而加劇了冠心病、心肌梗死及腦血栓、腦出血等心腦血管突發(fā)事件的發(fā)生.

藤茶是湖南武陵山區(qū)土家族常用保健飲品，藥食資源道地，開發(fā)價值很大.深入開展民族地區(qū)特色藥食資源保健產(chǎn)品開發(fā)，對發(fā)揮中醫(yī)藥及民族醫(yī)藥“藥食同源”的保健特色優(yōu)勢，促進民族地區(qū)特色食藥資源的可持續(xù)發(fā)展具有很大的意義；同時，將民族地區(qū)特色藥食資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的特色產(chǎn)品，可為民族地區(qū)實現(xiàn)可觀的經(jīng)濟效益和良好的社會效益.

本實驗研究結(jié)果表明，藤茶提取物對DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基均顯示出明顯的清除或抑制作用，總抗氧化能力明顯增加，且上述作用均呈一定的劑量依賴性.其中藥物對DPPH清除作用的IC50值為0.338 mg/mL，對羥基自由基清除作用的IC50值為18.713 mg/mL，對超氧陰離子抑制的最大活性值高達263.1 U/L，總抗氧化能力也達到19.764 mM.上述結(jié)果從不同抗氧化機制途徑方面證實了藤茶具有確切的體外抗氧化作用，值得進一步研究開發(fā).

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