徐賽華 胡靜娜

慢性腎臟病指腎臟系統(tǒng)代謝紊亂導(dǎo)致的腎臟結(jié)構(gòu)性破壞和功能性損害綜合征，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與免疫紊亂有關(guān)[1]。慢性腎小球腎炎發(fā)病率較高，西醫(yī)治療多用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，雖有較好的臨床療效，但長(zhǎng)期服用藥物副作用較大[2]。中醫(yī)認(rèn)為慢性腎小球腎炎是由于風(fēng)邪夾濕引起濕濁、瘀血，中醫(yī)藥在防治中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。具有“清熱除濕、消腫解毒”功效的黃葵膠囊對(duì)慢性腎小球腎炎具有較好的臨床療效。本研究旨在探討黃葵膠囊對(duì)慢性腎小球腎炎大鼠腎組織免疫功能和炎癥因子的影響，為其治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng) 物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量190±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0011。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2藥物與試劑 黃葵膠囊（規(guī)格：0.5g/粒，江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)20160123）；小牛血清白蛋白、不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司（批號(hào)16010627、16010556、16010581）；RIPA裂解試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)N16021766、p160102-1）；白介素-6（IL-6）、細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所公司（批號(hào)20160213、20160225、20160209）；大鼠 PITC CD3、PE CD4和CD8抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司（批號(hào)D160312、D160328、D160407）。

1.3儀 器 OLYMPUSAU5400全自動(dòng)生化分析儀，日本奧林巴斯有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰超凈工作臺(tái)凈化有限公司；SMZ660熒光顯微鏡，日本尼康公司；23R離心機(jī)，力康集團(tuán)力新儀器（上海）有限公司；DXI800化學(xué)發(fā)光儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司產(chǎn)品；FACSCanto流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1慢性腎小球腎炎大鼠模型建立[4-5]SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水12h后，取40只大鼠建立慢性腎小球腎炎模型。將適量小牛血清白蛋白溶于 0.01mol/L 的磷酸緩沖液（pH7.2～7.4）中，濃度為2mg/mL，與等體積不完全弗氏佐劑混成乳白色懸液，在大鼠雙側(cè)腋下、腹股溝作5點(diǎn)皮下注射，2mL/只。注射1周后，將溶有小牛血清白蛋白的磷酸緩沖液與等體積的完全弗氏佐劑混勻成濃度為1mg/mL的乳白色懸液，相同方式皮下注射。第3周取濃度為2mg/mL的小牛血清白蛋白的磷酸緩沖液1mL/只，進(jìn)行大鼠尾靜脈注射，建立慢性腎小球腎炎大鼠模型。

2.2實(shí)驗(yàn)分組和給藥 將50只SD大鼠按照性別分為兩個(gè)區(qū)組并編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、黃葵膠囊低、中、高劑量組及空白對(duì)照組，每組10只。除空白對(duì)照組外其余大鼠均造模。建模2周后空白對(duì)照組和模型組給予2mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，黃葵膠囊低、中、高劑量組分別給予0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg的黃葵膠囊灌胃，體積為2mL/（kg·d）。連續(xù)灌胃8周后處死各組大鼠，收集腎臟組織、尿液和血清樣本進(jìn)行檢查。

2.3指標(biāo)測(cè)定

2.3.1病理學(xué)觀察 取各組大鼠左側(cè)部分腎組織，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟切片包埋，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)變化。

2.3.2腎功能指標(biāo)檢測(cè) 取各組大鼠主動(dòng)脈血3mL，置不含抗凝劑的試管內(nèi)，室溫下自然凝集30min，2000r/min離心10min，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀分析腎功能指標(biāo)血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）含量。

2.3.3外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例檢測(cè) 取各組大鼠眼眶靜脈血至流式管中，分別加10μL入CD3、CD4和CD8單抗和50μL EDTA抗凝血，混合均勻，避光孵育20min，每管加入2mL溶血素，避光孵育20min，2000r/min離心10min，棄去上清，每管2mL PBS混勻，離心棄去上清，重復(fù)洗滌2次，棄上清，加2mL PBS重懸混勻后流式分析外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4和CD8比例。

2.3.4腎組織炎癥因子檢測(cè) 取各組大鼠右側(cè)腎臟組織樣本，經(jīng)RIPA裂解后，4℃以10 000r/min離心10min，BCA蛋白定量試劑盒在590nm處檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS電泳，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腎臟組織IL-6、ICAM-1和TGF-β1水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，計(jì)算光密度值。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（x±s） 表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1各組大鼠腎臟病理組織學(xué)比較 空白對(duì)照組大鼠腎小球、系膜基質(zhì)未見明顯病理變化，模型組大鼠腎小球硬化、系膜基質(zhì)增生，黃葵膠囊低、中、高劑量組大鼠腎臟病理變化均較模型組明顯減輕，呈劑量依賴性，但黃葵膠囊高劑量組大鼠腎臟病理變化仍較空白對(duì)照組嚴(yán)重。見圖1（封二）。

3.2各組大鼠腎功能指標(biāo)比較 模型組大鼠血清Scr、BUN和UA含量均高于空白對(duì)照組、黃葵膠囊低、中、高劑量組（P＜0.05），上述指標(biāo)隨黃葵膠囊劑量的增加含量降低。見表1。

表1 各組大鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）含量比較（x±s）

3.3各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例比較 模型組大鼠外周血CD3、CD4和CD4/CD8均明顯低于空白對(duì)照組和黃葵膠囊低、中、高劑量組，CD8高于空白對(duì)照組和黃葵膠囊低、中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

3.4各組大鼠腎組織炎癥因子水平比較 模型組大鼠腎組織IL-6、ICAM-1和TGF-β1水平均高于空白對(duì)照組，且明顯高于黃葵膠囊低、中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表2 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4和CD8比例比較（%，x±s）

表3 各組大鼠腎組織IL-6、ICAM-1、TGF-β1水平比較（光密度值，x±s）

4 討論

慢性腎小球腎炎病因復(fù)雜，是由多種病理類型組成的腎小球進(jìn)行性腎功能衰退疾病，是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因[6]。慢性腎小球腎炎外周血T淋巴細(xì)胞亞群紊亂，細(xì)胞炎癥因子表達(dá)升高，導(dǎo)致免疫功能紊亂，以及內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)異常，進(jìn)一步加劇其損傷程度[7]。ICAM-1受到炎性因子刺激后，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附，引起器官結(jié)構(gòu)和功能損傷，激活腎臟局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，加速腎病進(jìn)展。慢性腎小球腎炎的藥物防治以激素和免疫抑制劑為主，長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致多種副作用，對(duì)患者造成二次傷害[8-9]。黃葵膠囊聯(lián)合激素或免疫抑制劑，對(duì)慢性腎炎具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃葵膠囊可保護(hù)慢性腎小球腎炎大鼠腎臟組織，降低大鼠血清Scr、BUN和UA含量，減輕腎組織IL-6、ICAM-1和TGF-β1炎癥水平，穩(wěn)定外周血T淋巴細(xì)胞CD3、CD4和CD8亞群比例。藥理研究[10]表明，黃葵膠囊主要成分為植物黃蜀葵黃酮類化合物，具有抗感染消除、消除尿蛋白、抵抗血小板、增厚腎小球系膜、抗氧化、抑制腎小球免疫炎癥反應(yīng)、保護(hù)腎功能等作用。黃葵膠囊通過增加毛細(xì)血管通透性，消除機(jī)體過度自由基，減輕機(jī)體水腫，減輕腎小管間質(zhì)病變，改善機(jī)體微炎癥狀態(tài)和T淋巴細(xì)胞亞群紊亂狀態(tài)，減輕炎癥反應(yīng)和保護(hù)腎功能，且黃葵膠囊的作用呈劑量依賴性[11-12]。本研究提示黃葵膠囊可保護(hù)慢性腎小球腎炎大鼠腎臟組織，改善腎功能指標(biāo)，減輕炎癥反應(yīng)，改善免疫功能。

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