葉海南

非小細(xì)胞肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。在肺癌的治療中，以順鉑為代表的化療是一線化療方案。然而順鉑的長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)造成患者較大的副反應(yīng)，且肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性會(huì)隨著順鉑的長(zhǎng)期應(yīng)用而下降[2-3]。因此通過輔助治療藥物提高肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究的目的在于研究天然藥物活性成分川楝素對(duì)順鉑抗肺癌活性的協(xié)同效應(yīng)并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材 料 川楝素（批號(hào)58812-37-6）購于南京春秋生物工程有限公司。順鉑（批號(hào)P4394）、噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào) M2128）和凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)APOAF）購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)11995065）購于美國Gibco。X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）和 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)#14334、#9502、#9662、#4970）購于美國 Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠（批號(hào)SC-2002）購于美國Santa Cruz。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（批號(hào) 32196）購于美國 Pierce。脂質(zhì)體 2000（Lipofectamine 2000）（批號(hào) 11668019）和 pcDNA3.1（批號(hào)V79520）購于美國 Invitrogen。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細(xì)胞每2～3天傳代一次，傳代時(shí)，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.3XIAP重組質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將XIAP基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成XIAP重組過表達(dá)質(zhì)粒。A549細(xì)胞接種在6孔板中孵育過夜使之貼壁。將空質(zhì)?；騒IAP質(zhì)粒（終濃度為2μg/mL）用Lipofectamine2000進(jìn)行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的A549細(xì)胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6h，之后棄去無血清培養(yǎng)基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞活力抑制率測(cè)定 將A549細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板中，分為對(duì)照組、川楝素組、順鉑組、川楝素+順鉑組及川楝素+順鉑+XIAP質(zhì)粒組。對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A549不加藥物處理48h，川楝素組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A549加入10μmol/L川楝素處理48h，順鉑組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A549加入2μmol/L順鉑處理48h，川楝素+順鉑組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A549加入2μmol/L順鉑和10μmol/L川楝素處理48h，川楝素+順鉑+XIAP質(zhì)粒組為轉(zhuǎn)染XIAP質(zhì)粒的A549加入2μmol/L順鉑和10μmol/L川楝素處理48h。藥物處理完畢后加入 20μL MTT（5mg/mL）37°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100μL二甲亞砜，570nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。細(xì)胞活力抑制率計(jì)算公式：細(xì)胞活力抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

1.5免疫共沉淀 將A549細(xì)胞按上述分組處理后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取2×106個(gè)的各組細(xì)胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質(zhì)?？偟鞍踪|(zhì)分成等量?jī)煞荩环菰诘鞍滋崛∫褐屑尤隭IAP抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后離心收集管底的瓊脂糖珠。瓊脂糖珠加入Western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min使蛋白質(zhì)與糖珠分離，用于進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。另一份用作免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的對(duì)照（Input）直接進(jìn)行Sestern blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Caspase-9和Caspase-3的總量。

1.6Western blot實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞按上述分組處理后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取2×106個(gè)的各組細(xì)胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質(zhì)。將上述總蛋白質(zhì)用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用XIAP、Caspase-9、Caspase-3 和 β-actin 抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.7細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞按上述分組處理后按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶（PI）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s） 表示并用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，兩組間均數(shù)比較采用Student’s t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1川楝素顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川楝素+順鉑組A549的細(xì)胞活力抑制率顯著高于順鉑單處理組和川楝素單處理組（P＜0.05）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川楝素+順鉑組A549的細(xì)胞凋亡率顯著高于順鉑單處理組和川楝素單處理組，見表1。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明川楝素顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

2.2川楝素通過下調(diào)XIAP的表達(dá)抑制A549細(xì)胞中XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川楝素處理能顯著降低A549細(xì)胞中XIAP的表達(dá)水平（圖1）。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組A549細(xì)胞中Caspase-9和Caspase-3的總蛋白量（Input）無差別，但川楝素處理能顯著抑制XIAP與Caspase-9和Caspase-3的結(jié)合（圖2）。這些結(jié)果表明川楝素能通過下調(diào)XIAP的表達(dá)抑制A549細(xì)胞中XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用。

表1 川楝素對(duì)順鉑抗肺癌活性的干預(yù)作用（%，x±s）

圖1 川楝素對(duì)XIAP表達(dá)的干預(yù)作用

圖2 川楝素抑制XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用

2.3川楝素通過抑制A549細(xì)胞中XIAP的表達(dá)增強(qiáng)順鉑的凋亡誘導(dǎo)活性 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川楝素能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞Caspase-9和Caspase-3的活化，但轉(zhuǎn)染XIAP質(zhì)粒能顯著抑制兩者聯(lián)合對(duì)A549細(xì)胞Caspases的活化（圖3）。這表明川楝素通過抑制A549細(xì)胞中XIAP的表達(dá)增強(qiáng)順鉑的凋亡誘導(dǎo)活性。

3 討論

川楝素是中藥川楝子的主要活性成分，具有很強(qiáng)的藥理學(xué)活性。近年研究發(fā)現(xiàn)川楝素還具有一定的抗腫瘤作用，對(duì)多種惡性腫瘤均有良好的輔助治療作用[4-6]。本研究顯示，川楝素能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，表明川楝素與順鉑存在協(xié)同效應(yīng)，能提高順鉑的抗肺癌活性。

XIAP屬于抗凋亡蛋白家族成員，它能與Caspases結(jié)合，從而阻止Caspases的活化，抑制凋亡的發(fā)生[7]。研究表明，腫瘤細(xì)胞中XIAP的過度表達(dá)能引起腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗，從而影響癌癥患者的預(yù)后。因此XIAP目前已成為腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝素能顯著下調(diào)肺癌細(xì)胞中XIAP的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用。因此將肺癌細(xì)胞用川楝素處理后，細(xì)胞中游離Caspase-9和Caspase-3的水平顯著增加，更多的Caspase-9和Caspase-3能在凋亡信號(hào)的作用下發(fā)生活化，最終導(dǎo)致肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)用XIAP表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)肺癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá)后，川楝素對(duì)順鉑的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制，證明川楝素是通過下調(diào)肺癌細(xì)胞中XIAP的蛋白表達(dá)增強(qiáng)順鉑介導(dǎo)的Caspase-9和Caspase-3的活化，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。

綜上所述，川楝素能顯著提高肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤活性。這些研究為提高順鉑的療效降低其使用劑量提供了新的策略和思路。

圖3 川楝素對(duì)A549細(xì)胞Caspase-9和Caspase-3活化的干預(yù)作用

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