程小紅，邢 斌，劉建紅，趙英勇，毛加榮， 張曉鳳，于小勇

1.陜西省中醫(yī)藥研究院 陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)，2.西北大學生命科學院(西安 710069)

各種慢性腎臟疾病隨著病情的進展，均可出現(xiàn)程度不同的腎臟間質(zhì)纖維化改變[1]。根據(jù)腎臟間質(zhì)纖維化形成后的形態(tài)學特征與病理屬性特點，結(jié)合全身臨床表現(xiàn)，我們以益腎散結(jié)立法組方研制出院內(nèi)制劑-腎復康Ⅱ號膠囊，應用于臨床10余年。本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻方法復制大鼠腎臟間質(zhì)纖維化模型，觀察益腎散結(jié)法中藥制劑-腎復康Ⅱ號膠囊對纖維化腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)表達的影響，以探討其部分作用機理。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物:清潔健康SD大鼠72只，雄性，2～3月齡，體重(200±20) g，購于西安交通大學醫(yī)學院動物中心，使用許可證號為SCXK(陜)2012-003。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術(shù)組、模型組、治療組、對照組，每組18只。

1.2 研究用藥:腎復康Ⅱ號膠囊為院內(nèi)制劑，由陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，批號：陜藥管字[2001]第1168號；百令膠囊(國藥準字Z10910036，杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn))。

1.3 主要實驗用儀器試劑:LeiCASM2000R型切片機、江蘇常州YABO石蠟包埋機、OlympusBX 41顯微鏡、北京中科 HMIAS-2000圖像采集與分析系統(tǒng)等由陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病實驗室提供。TGF-β1抗體及PAI-1抗體試劑盒(兔抗人、鼠多抗)、生物素藕聯(lián)羊抗兔IgG、鏈霉卵白素標記的辣根過氧化物酶(HRP)工作液、DAB染色劑：均購自武漢博士德生物制劑公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型的制備:大鼠腎間質(zhì)纖維化模型的復制采用目前公認而成熟的輸尿管結(jié)扎方法[2]。

2.2 實驗分組及給藥方法:將72只雄性SD大鼠隨機分為4組，平均每組18只。

治療組：以腎復康Ⅱ號膠囊顆粒405 mg/(kg·d)灌胃；對照組：以百令膠囊顆粒270 mg/(kg·d)灌胃；假手術(shù)組、模型組：均以生理鹽水灌胃。

將上述劑量的腎復康Ⅱ號膠囊顆粒和百令膠囊顆粒以溫開水溶解制成混懸液，于造模后一天開始給各組大鼠以1 ml/100g灌胃，假手術(shù)組及模型組大鼠同一時間以等體積的生理鹽水灌胃。

2.3 標本采集:分別于灌胃后第2周、3周、4周時每組處死6只動物，剖取左臟以10%甲醛固定，留作病理檢查標本。

2.4 觀測指標

2.4.1 腎臟間質(zhì)纖維化相對面積:將腎臟組織切片進行Masson染色，用日本奧林帕斯光學顯微鏡觀察腎臟間質(zhì)纖維化情況，以圖像采集系統(tǒng)在光鏡20倍下采集腎皮質(zhì)中10個不含腎小球且互不重疊的視野，以圖像分析系統(tǒng)計算每例切片、每個視野腎臟間質(zhì)的綠染面積，計算平均數(shù)作為腎臟間質(zhì)纖維化的面積[3]。

2.4.2 普通光學顯微鏡下觀察腎纖維化組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色表達情況:將石蠟包埋的腎臟組織切片，根據(jù)試劑盒說明書介紹的方法及步驟進行TGF-β1、PAI-1免疫組化染色，用日本奧林帕斯光學顯微鏡觀察TGF-β1及PAI-1表達情況。

結(jié) 果

1 各組腎臟間質(zhì)纖維化情況 將腎組織切片進行Masson染色。厚度為3μm的石蠟切片脫蠟至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min，酒精1 min；10%重鉻酸鉀與10%三氯醋酸1∶1的比例混合染15 min；水洗、蒸餾水洗；1%天青石蘭染8 min；水洗、蒸餾水洗；Mager蘇木素染6 min；水洗、蒸餾水洗；在1%的冰醋酸中放置2 min，取出擦干組織周圍的冰醋酸放在濕盒中；將1%的酸性品紅與1%的麗春紅以2∶1的比例混合滴在組織上染22 min；用1%的冰醋酸將切片的品紅、麗春紅洗干凈后在磷鉬酸中涮幾下，滴染亮綠5 min；用1%的冰醋酸洗干凈亮綠，擦干組織周圍的冰醋酸，直接以100%酒精快速脫水、透明、封片。顯微鏡下20倍視野觀察病理變化，各時間點各組大鼠腎小管及腎臟間質(zhì)病理變化情況見圖1。假手術(shù)組大鼠腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常；隨著時間的延長，模型組腎臟間質(zhì)纖維化程度逐漸加重；與模型組比較，治療組及對照組腎臟間質(zhì)纖維化程度較輕。結(jié)果見表1。

假手術(shù)組 UUO UUO+腎復康Ⅱ號膠囊 UUO+百令膠囊

圖1 各組腎組織Masson染色病理改變(Masson染色×20)

注：與假手術(shù)組比較,△P<0.05;與模型組比較，*P<0.05;治療組與對照組比較,☆P>0.05

表1可見,模型組及藥物組、對照組腎臟間質(zhì)均有不同程度的纖維化，與假手術(shù)組相比具有顯著差異 (P<0.05)。在14 d、21 d、28 d三個不同觀測時點，治療組及對照組腎臟間質(zhì)纖維化面積增加程度均明顯較模型組為輕，纖維化面積較模型組明顯減少(P<0.05)；但治療組和對照組之間無顯著差異(P>0.05)，說明治療藥物-腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物-百令膠囊均對腎臟間質(zhì)纖維化的形成有一定抑制作用。

2 腎組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色表達情況

2.1 腎組織TGF-β1、PAI-1免疫組化染色方法:將各組3～4 μm腎組織石蠟切片，脫蠟、水化、滅活、微波修復抗原。滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，分別加PAI-1抗體(兔抗人、鼠多抗)稀釋度1∶300、TGF-β1抗體(兔抗人、鼠多抗)稀釋度1∶50，37度烤箱孵育1 h，加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫下孵育15～20 min，加鏈霉卵白素標記的辣根過氧化物酶(HRP)工作液室溫下孵育15～20 min，DAB顯色15 min，蘇木素中復染細胞核2 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下20倍視野觀察染色表達情況。

2.2 腎組織免疫組化染色TGF-β1表達情況:見圖2。

假手術(shù)組 UUO UUO+腎復康Ⅱ號膠囊 UUO+百令膠囊

圖2 各組腎組織免疫組化染色TGF-β1表達情況(免疫組化染色× 20)

圖2可見,在假手術(shù)組，第2周和第3周TGF-β1均無表達，第4周時僅有少量表達；在模型組，各時間觀測點TGF-β1均明顯表達，且隨時間延長而更加顯著； 治療組及對照組，在各時間觀測點TGF-β1表達均較模型組減弱，說明治療藥物腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物百令膠囊均能抑制TGF-β1在腎間質(zhì)中的過度表達。

2.3 腎組織免疫組化染色PAI-1表達情況:見圖3。腎復康Ⅱ號膠囊和百令膠囊均能抑制PAI-1的表達。

假手術(shù)組 UUO UUO+腎復康Ⅱ號膠囊 UUO+百令膠囊

圖3 各組腎組織免疫組化染色PAI-1表達情況(免疫組化染色×20)

圖3可見,在假手術(shù)組，各時間觀測點PAI-1均無表達；在模型組，各時間觀測點PAI-1均明顯表達，且隨時間延長而更加顯著； 治療組及對照組，在各時間觀測點PAI-1表達均明顯較模型組為弱，說明治療藥物-腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物-百令膠囊均能抑制PAI-1在腎間質(zhì)中的表達。

討 論

在腎組織中，所有固有細胞均可表達和分泌TGF-β1[4]。TGF-β1能刺激成纖維細胞以增加細胞外基質(zhì)

(ECM)成分合成，抑制多種ECM降解酶活性從而抑制ECM降解，可促使腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化[5]。PAI-1能抑制ECM降解，導致或促進組織器官硬化或纖維化。PAI-1也是一個重要的促纖維化因子[6]，各種原因所致腎損傷時均有不同程度的表達[7]。

單側(cè)輸尿管梗阻導致腎臟間質(zhì)纖維化模型的特點是進行性的小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化，腎臟間質(zhì)纖維化即腎組織瘢痕形成后，病理改變具有固定不移、經(jīng)久不愈的特點，與“瘀血”致病特征相似[8]，腎小管功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，常出現(xiàn)夜尿增多、乏力等脾腎氣虛證候，故“益腎散結(jié)”是微觀辨證與整體辨證有機結(jié)合而確立的治法。既往研究證明，“益腎散結(jié)”中藥制劑-復康Ⅱ號膠囊能減輕腎臟間質(zhì)纖維化的程度[9-10]。研究結(jié)果顯示：UUO組、治療組及對照組大鼠腎纖維化組織中TGF-β1、PAI-1表達顯著高于假手術(shù)組，也證明TGF-β1、PAI-1是促進腎臟間質(zhì)纖維化的主要因子。但治療組和對照組與模型組比較，TGF-β1、PAI-1表達明顯減弱，表明腎復康Ⅱ號膠囊抑制腎臟間質(zhì)纖維化形成的部分機制，是通過抑制腎臟組織TGF-β1和PAI-1表達而實現(xiàn)的。盡管腎復康Ⅱ號膠囊和對照藥物百令膠囊均對腎臟局部的病理改變有相似的作用，但針對全身表現(xiàn)而“益腎”、針對腎臟局部病理改變而“散結(jié)”是其優(yōu)勢所在。

[1] Qstendorf T，Boor P,van Roeyen CR，etal. Platelelet-derived growth factors (PDGFs) in glomerular and tubulointerstitial fibrosis [J]. Kidney Int Suppl,2014,4(1):65-69.

[2] Diamond JR , Ricardo SD , Klahr S. Mechanisms of interstitial fibrosis in obstructive nephropathy[J]. Semin Nephrol, 1998, 18:594-602.

[3] 董健平，陳香美，師鎖柱，等.金屬蛋白酶組織抑制劑1在大鼠腎小管間質(zhì)損害中的表達及其意義[J]. 中華腎臟病雜志，2002，18(2)：275-279.

[4] 王曉瑩,王繼明.腎小管間質(zhì)纖維化與細胞因子調(diào)控異常相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學，2007,28(17):1913.

[5] Sato M，Muragaki Y，Saika S，etal. Targeted disruption of TGF-betal/Smad3 signaling protecst against renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral obstruction [J]．J Clin Invest，2003，112(10)：1486-1494．

[6] Zhang G，Kernan KA，Collins SJ，etal．Plasmin ( ogen) promotes renal interstitial fibrosis bypromoting epithelial-to-mesenchymal transition: role of plasmin-activatedsignals[J].J Am Soc Nephrol，2007，18(3): 846-859．

[7] 程 暉，丁國華，陳 鋮，等.尿激酶型纖溶酶原激活物對糖尿病大鼠腎臟系膜基質(zhì)的影響[J].中華糖尿病雜志，2011，3(4)：324-327.

[8] 程小紅，于小勇，毛加榮.IgA腎病的病理改變與中醫(yī)微觀辨證[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2014,15(2):185-186.

[9] 史 健，劉建紅，程小紅. 腎復康Ⅱ號膠囊對大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響[J].陜西中醫(yī),2012,33(9):1238-1240.

[10] 史 健，楊洪濤，胡 銳，等. 腎復康Ⅱ號抗腎間質(zhì)纖維化及對人腎上皮小管細胞轉(zhuǎn)分化的作用[J].陜西中醫(yī),2014,35(1):103-105.