毛加榮， 徐 薇，劉建紅，于小勇， 張曉鳳，趙英勇，程小紅△

1.陜西省中醫(yī)藥研究院 陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)，2.西北大學(xué)生命科學(xué)院(西安 710069)

腎臟間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病發(fā)展到后期的共同病理學(xué)特征[1]，是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同通路[2]，我們將中醫(yī)整體辨證與腎臟局部病理改變的微辨證有機(jī)結(jié)合起來，以益腎散結(jié)立法組方，在已取得臨床療效的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)研究觀察其對(duì)腎功能及腎臟間質(zhì)纖維化的影響，以期為整體辨證與微觀辨證有機(jī)結(jié)合防治慢性腎臟疾病提供客觀依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料與藥物

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔健康雄性SD大鼠72只，體重180±20 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組、對(duì)照組，每組18只。各組均采用分養(yǎng)法，動(dòng)物室溫度保持在26～28 ℃，濕度68%～72%，自由飲水和自然晝夜節(jié)律光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥：腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊為陜西省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由山萸肉、菟絲子、姜黃、莪術(shù)等組成(陜藥管字[2001]第1168號(hào))；百令膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10910036，杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn))。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器：萊卡切片機(jī)(LeiCASM2000R)、國(guó)產(chǎn)石蠟包埋機(jī)(YABO，江蘇常州)、日本奧林帕斯顯微鏡(OlympusBX 41)、圖像采集與分析系統(tǒng)(北京中科 HMIAS-2000)由陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病實(shí)驗(yàn)室提供，日立全自動(dòng)生化分析儀(7180)由陜西省中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的制備:以10%水合氯醛腹腔注射以麻醉大鼠，模型組、治療組、對(duì)照組大鼠剖開腹腔后用眼科鑷子分離左側(cè)輸尿管，于左腎下極處用絲線結(jié)扎輸尿管，然后縫合腹腔。假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎。術(shù)后傷口外涂紅霉素軟膏防止感染。

2.2 給藥方法：造模術(shù)后第一天開始，治療組以腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊顆粒405 mg/(kg·d)水溶混懸液灌胃;對(duì)照組以百令膠囊顆粒270 mg/(kg·d)水溶混懸液灌胃;假手術(shù)組及模型組以藥物同等體積的生理鹽水灌胃，灌胃容積為1 ml/100g。

2.3 標(biāo)本的采集與觀察指標(biāo)：分別于灌胃后第7天、第14天、第21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組處死6只大鼠，腹主動(dòng)脈取血3 ml以備檢測(cè)血清肌酐、血尿素氮；剖取左側(cè)腎臟以10%的甲醛溶液固定，留作病理檢查標(biāo)本。

結(jié) 果

1 生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，UUO模型組大鼠血清肌酐在造模后第1、2、3周均顯著升高;UUO+治療組大鼠血清肌酐與模型組比較明顯降低，且在第1周和第3周有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異;對(duì)照組僅對(duì)第1周UUO大鼠的血清肌酐有顯著影響(圖1A)。與正常對(duì)照組相比，UUO模型組大鼠血清尿素氮在第1、2、3周均顯著升高; UUO+治療組大鼠血清尿素氮與模型組比較明顯下降，且在第1、2、3周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(圖1B);對(duì)照組對(duì)大鼠血清尿素氮也有不同程度的降低。

2 腎臟形態(tài)改變 肉眼觀察假手術(shù)組兩側(cè)腎臟組織情況，外形均無明顯異常,各時(shí)間觀察點(diǎn)雙腎呈紅褐色，包膜緊致而有光澤。模型組于造模后第2 周，左側(cè)腎臟體積較對(duì)側(cè)明顯増大，可見水腫、表面凹凸不平、腎孟高度擴(kuò)張；腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊組和對(duì)照藥百令膠囊組大鼠腎臟體積増大程度、腎盂擴(kuò)張等改變均較模型組為輕。

(A)正常對(duì)照組、UUO模型組、UUO+腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊和UUO+百令膠囊組灌胃治療組第1、2、3周大鼠血清肌酐含量。(B)正常對(duì)照組、UUO模型組、UUO+腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊和UUO+百令膠囊組灌胃后第1、2、3周大鼠血清尿素氮的含量。模型組與正常對(duì)照組比較，#P<0.05,##P<0.01；腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊組或百令膠囊組與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 大鼠血清生化指標(biāo)的結(jié)果

3 腎臟病理學(xué)改變

3.1 腎組織HE染色和PAS染色病理改變

3.1.1 HE染色方法:①脫蠟至水；②Harris 蘇木素染7 min；③水洗，蒸餾水洗；④0.5%鹽酸酒精分化數(shù)秒(涮2下)；⑤水洗，蒸餾水洗；⑥1%氨水返藍(lán)數(shù)秒；⑦水洗，蒸餾水洗；⑧ 0.5%醇溶伊紅染核數(shù)秒(涮1下)；⑨脫水、透明、封片。顯微鏡下20倍視野觀察病理變化。

3.1.2 PAS染色方法:①脫蠟至水，1%高碘酸水溶液染10 min；②蒸餾水沖洗；③將切片擦干放在墨盒中，滴加Schiff試劑，蓋上盒蓋反應(yīng)30 min，待組織顏色變紅，將切片放染缸中流水沖洗10 min，沖完蒸餾水洗2次；④Harris蘇木素染核5 min；⑥0.5%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗，蒸餾水洗；⑦1%氨水返藍(lán)數(shù)秒，水洗，蒸餾水洗；⑧脫水、透明、封片。顯微鏡下20倍視野觀察病理變化。

3.1.3 病理改變:假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)腎臟組織無明顯病理改變，腎小管上皮細(xì)胞胞排列整齊，腎間質(zhì)無水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組于造模后1周，左側(cè)腎組織部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)灶狀水腫及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)； 隨著梗阻時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)部分脫落、扁平與再生改變，小灶狀或灶狀腎小管萎縮，并可見代償擴(kuò)張，腎間質(zhì)輕度水腫及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； 造模后2周，上述改變進(jìn)一步加重，腎小管萎縮及腎臟間質(zhì)纖維化面積增大；3周后腎小管萎縮和腎臟間質(zhì)纖維化程度更為明顯，而治療組和對(duì)照組各時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)各種病變程度都明顯輕于模型組(圖 2、圖3)。

圖2 正常對(duì)照組、UUO模型組、UUO+腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊和UUO+百令膠囊組灌胃后第1、2、3周SD大鼠腎組織HE染色分析(HE染色×20)

圖3 正常對(duì)照組、UUO模型組、UUO+腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊和UUO+百令膠囊組

3.2 腎組織Masson染色病理改變

3.2.1 染色方法:①脫蠟至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min，酒精1 min；②10%重鉻酸鉀與10%三氯醋酸1:1的比例混合染15 min；③水洗、蒸餾水洗；④1%天青石蘭染8 min；⑤水洗、蒸餾水洗；⑥Mager蘇木素染5～7 min；⑦水洗、蒸餾水洗；⑧在1%的冰醋酸中放置1～2 min，取出擦干組織周圍的冰醋酸放在濕盒中；⑨將1%的酸性品紅與1%的麗春紅以2∶1的比例混合滴在組織上染22～23 min；⑩用1%的冰醋酸將切片的品紅、麗春紅洗干凈后在磷鉬酸中涮幾下，滴染亮綠5 min；用1%的冰醋酸洗干凈亮綠，擦干組織周圍的冰醋酸，直接以100%酒精快速脫水、透明、封片。顯微鏡下20倍視野觀察病理變化。

3.2.2 病理改變:見圖4。治療組和對(duì)照組各時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)各種病變程度都明顯輕于模型組。

圖4 正常對(duì)照組、UUO模型組、UUO+腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊和UUO+百令膠囊組灌胃

假手術(shù)組在第1、2、3周Masson染色未見明顯改變；UUO模型組隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟間質(zhì)纖維化面積逐漸增大。單側(cè)輸尿管梗阻后第1周，可見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，未見明顯間質(zhì)增寬和膠原纖維沉積; 單側(cè)輸尿管梗阻后第2周，腎間質(zhì)膠原纖維沉積，局部纖維化; 單側(cè)輸尿管梗阻后第3周，間質(zhì)膠原纖維進(jìn)一步增多，纖維化面積進(jìn)一步增大，纖維化程度進(jìn)行性加重。

討 論

無論何種原因?qū)е碌哪I小球疾病、腎小管間質(zhì)疾病或腎血管疾病，隨著疾病的進(jìn)展，均可導(dǎo)致腎小管萎縮和腎臟間質(zhì)纖維化。其特征為腎臟間質(zhì)中大量細(xì)胞外基質(zhì)積聚，導(dǎo)致腎臟逐步減退[3]。因此，腎功能的惡化，很大程度上取決于腎臟間質(zhì)纖維化的程度[4]。腎臟間質(zhì)纖維化、腎組織瘢痕形成的病理改變具有固定不移、經(jīng)久不愈的特點(diǎn)，與“瘀血”致病特征相似[5]，腎絡(luò)成積是其微觀辨證的基本病機(jī)[6]。由于腎小管萎縮，腎小管濃縮功能障礙，臨床表現(xiàn)為夜尿增多、小便清長(zhǎng)等癥狀，常出現(xiàn)中醫(yī)腎氣不足證候。隨著腎臟間質(zhì)纖維化程度的加重，腎臟間質(zhì)纖維成分增多，腎臟小動(dòng)脈管壁玻璃樣變，逐步導(dǎo)致腎小球硬化，且臨床表現(xiàn)千變?nèi)f化，與中醫(yī)“痰”之致病特征相關(guān)[5]。將顯微鏡下微觀的病理變化與中醫(yī)辨證有機(jī)結(jié)合，全身表現(xiàn)為腎氣不足表現(xiàn)，腎臟局部痰、瘀互結(jié)，具有“不動(dòng)難破”特征，因此腎臟間質(zhì)纖維化的中醫(yī)病機(jī)可概括為腎氣不足、痰瘀互結(jié)，以益腎散結(jié)立法，由山萸肉、炒杜仲、仙靈脾、醋鱉甲、王不留行、姜黃、僵蠶、莪術(shù)等組成方劑，并研發(fā)為“腎復(fù)康Ⅱ膠囊”用于臨床取得了較好療效。

為了證實(shí)其臨床療效的可靠性,并闡明其作用機(jī)制,我們開展了實(shí)驗(yàn)研究。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO) 模型的主要病理改變以腎臟間質(zhì)纖維化為特征，且呈進(jìn)行性加重過程，是目前公認(rèn)的腎臟間質(zhì)纖維化模型[7]，多在造模后第2周左右出現(xiàn)較為明顯的纖維化改變[8-9]。本研究采用UUO模型研究益腎散結(jié)法制劑-腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊對(duì)腎功能的影響及其抗大鼠腎臟間質(zhì)纖維化的效果。研究結(jié)果顯示，進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎后，梗阻側(cè)腎盂積水，腎間質(zhì)水腫，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、崩解脫落，因而腎小球受壓，腎小囊壓力升高，腎小球?yàn)V過功能下降，血肌酐、尿素氮升高。UUO+治療組大鼠血清肌酐、尿素氮在不同時(shí)點(diǎn)與模型組比較均明顯下降，說明益腎散結(jié)法及其制劑對(duì)腎功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊抑制小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化有關(guān)[10]。隨著輸尿管梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，腎小管萎縮，腎臟間質(zhì)纖維化形成。單側(cè)輸尿管梗阻后第1周，病理改變以腎小管上皮細(xì)胞空泡變性為主，梗阻后第2周腎臟間質(zhì)膠原纖維沉積，局部纖維化；單側(cè)輸尿管梗阻后第3周，腎臟間質(zhì)膠原纖維進(jìn)一步增多，纖維化面積進(jìn)一步增大，纖維化程度進(jìn)行性加重，造模后腎臟病理改變及纖維化形成過程與文獻(xiàn)報(bào)道基本相擬[8-9]。研究證實(shí)，治療組和對(duì)照組在各時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)腎臟各種病變程度都明顯輕于模型組(圖4)，說明腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊對(duì)腎臟間質(zhì)纖維化具有抑制作用，同時(shí)說明整體辨證與微觀改變有機(jī)結(jié)合的認(rèn)識(shí)與組方原則有其內(nèi)在的科學(xué)依據(jù)，也是取得臨床較好療效的內(nèi)在基礎(chǔ)。

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