王 淵，劉智斌，牛文民，王 強(qiáng)，李 杰，魯 剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見(jiàn)的癡呆癥，約占癡呆患者的60%～80%，絕大多數(shù)AD患者發(fā)病前期無(wú)明顯征兆，一旦出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙等典型表現(xiàn)時(shí)已處于中晚期[1]。研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺(jué)功能障礙是AD早期較為常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一[2-3]，如能在AD早期對(duì)嗅覺(jué)功能障礙進(jìn)行干預(yù)，將有可能延緩AD發(fā)病進(jìn)程。研究表明，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein ，Aβ)的沉積和累積所引起的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致AD的基本病因之一，而Aβ由淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)裂解所產(chǎn)生[4]?！靶崛槨悲煼ㄊ莿⒅潜蠼淌诙嗄陙?lái)治療癡呆的經(jīng)驗(yàn)針?lè)ǎ瑢?duì)其具有明顯的優(yōu)勢(shì)和確切的臨床療效。本研究擬通過(guò)切斷和保留嗅覺(jué)通路，觀察嗅三針對(duì)AD小鼠空間記憶能力和海馬APP、 Aβ蛋白表達(dá)的影響，以揭示嗅三針治療AD的作用機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng)物和分組 采用Morris水迷宮檢測(cè)，剔除不合格的動(dòng)物，篩選后選取7個(gè)月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(AD模型小鼠)40只，隨機(jī)分為4組，同窩陰性小鼠10只作為正常對(duì)照組。Ⅰ組(sham)：正常對(duì)照組；Ⅱ組(model)：AD模型組；Ⅲ組(XSZ)：嗅三針組；Ⅳ組(XSZ+XSJ)：嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組；Ⅴ組(Donepezil )：鹽酸多奈哌齊組，每組10只。動(dòng)物均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物批號(hào)：SCXK(寧)2016-003，體重(35.8±4.22)g。

AD模型組、正常組與三個(gè)干預(yù)組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激，但不做電針刺激；嗅三針組行嗅三針干預(yù)；嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組在AD小鼠行嗅神經(jīng)切斷術(shù)后行嗅三針干預(yù)；鹽酸多奈哌齊組以3 mg/(kg·d)的劑量，對(duì)AD小鼠進(jìn)行灌胃；以上各組均1次/d，5 d為1個(gè)療程，休息2 d，共進(jìn)行4個(gè)療程。

2 主要儀器與試劑 韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(型號(hào)：HANS-200A型，由南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn))，Morris水迷宮(型號(hào)：XR-XM101型，由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn))，西格瑪臺(tái)式高速離心機(jī)(型號(hào)：3-16PK型，由德國(guó)Sigma公司生產(chǎn))，電泳儀(型號(hào)：NYCP-34ACG型，由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn))，華佗針灸針(規(guī)格：0.25 mm×13 mm，由蘇州醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn))，兔Aβ一抗和兔APP一抗(由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)), 山羊抗兔二抗(由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。

3 嗅神經(jīng)切斷術(shù)模型制作 參照文獻(xiàn)[5]對(duì)AD小鼠在行嗅神經(jīng)切斷術(shù)，采用水合氯醛將AD小鼠進(jìn)行麻醉，應(yīng)用立體定位儀將麻醉后的小鼠固定其上，切開(kāi)小鼠顱頂正中區(qū)域的皮膚并小范圍分離，以使得其前囟充分暴露，于矢狀靜脈竇、鼻額縫與眼眶上內(nèi)側(cè)緣之間鉆兩個(gè)小孔以暴露嗅球，均以1 mm為直徑，位于嗅球前端的硬腦膜將其用顯微解剖鑷提起，對(duì)于充分暴露的嗅神經(jīng)采用銳性切斷術(shù)，原則上使嗅球不致?lián)p傷，對(duì)于出血處采用明膠海綿進(jìn)行壓迫，并將青霉素點(diǎn)在傷口處，最后進(jìn)行傷口縫合。

4 嗅三針干預(yù)方法 動(dòng)物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后仰臥位放置于預(yù)先加熱的小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。取穴：迎香(雙側(cè))和印堂。迎香(定位)：小鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無(wú)毛交界處；印堂(定位)：小鼠兩眼眶上緣中點(diǎn)連線與正中線交點(diǎn)[6]。操作方法：采用0.25mm×13mm寸毫針，對(duì)于迎香采用斜刺法，進(jìn)針深度為2 mm，方向朝向內(nèi)上方，對(duì)于印堂采用平刺法，進(jìn)針深度為2 mm，方向朝向鼻根部；對(duì)于印堂將電針的正極接于其上，對(duì)于一側(cè)迎香將電針的負(fù)極接于其上，刺激時(shí)間為10 min，之后將電針的負(fù)極換接于另側(cè)迎香上，刺激時(shí)間為10 min。刺激參數(shù)：疏密波，頻率為2/15HZ，強(qiáng)度為1 mA。

5 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn) 空間探索實(shí)驗(yàn)：于干預(yù)治療的最后一天，在Morris水迷宮環(huán)境、池水溫度、定位航行試驗(yàn)不發(fā)生變化的條件下，去除水迷宮下的站臺(tái)，然后將小鼠放置于第3象限面壁池內(nèi)，用電腦記錄并分析小鼠60 s內(nèi)所經(jīng)過(guò)的游泳路線，清理小鼠身上水漬，放入鼠籠。其他象限的實(shí)驗(yàn)則無(wú)需再進(jìn)行。通過(guò)記錄小鼠第3象限時(shí)間占總時(shí)間的百分比以及穿越平臺(tái)次數(shù)，評(píng)估小鼠的空間記憶能力。

6 免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)海馬水平APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后，快速取海馬組織，裝入EP管后迅速放入液氮，移入-80度保存?zhèn)溆?。WB檢測(cè)步驟如下：將海馬(等量大小)樣本剪取后，放置于EP管中，將RIPA蛋白裂解液(等體積預(yù)冷)加入到每份等量的海馬樣本中，采用超聲破碎儀對(duì)其研磨，高速冷凍離心機(jī)4 ℃、1500 r/min離心。對(duì)于各樣本的蛋白濃度的測(cè)定，采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，蛋白上樣量的劑量經(jīng)確定約30 μg，并將5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入其中。對(duì)于目標(biāo)蛋白，將其上樣后，再進(jìn)行為時(shí)1 h的電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉， 再加入一抗兔抗鼠APP(1∶100)和Aβ(1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。然后經(jīng)二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶100)，常溫下孵育1 h，TBST洗滌，使用ECL試劑盒顯影5 min，將目標(biāo)蛋白曝光完畢后，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算目標(biāo)條帶灰度值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，取均值分析。實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參照物。

結(jié) 果

1 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù) 見(jiàn)表1。通過(guò)單因素方差分析，其結(jié)果顯示：通過(guò)空間探索實(shí)驗(yàn)，在對(duì)靶象限(第三象限)的觀察統(tǒng)計(jì)中得出，五組小鼠在實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)的次數(shù)分別為：空白組1.82次，模型組0.71次，嗅三針組1.41次，嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組0.76次，鹽酸多奈哌齊組1.53次。嗅三針組在靶象限(第三象限)穿臺(tái)次數(shù)成績(jī)居中，高于模型組，低于空白對(duì)照組。

表1 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)靶象限時(shí)間占總時(shí)間百分比 見(jiàn)表2。通過(guò)單因素方差分析，其結(jié)果顯示：通過(guò)空間探索實(shí)驗(yàn)，在對(duì)靶象限(第三象限)所占總時(shí)間(60 s)的百分比觀察統(tǒng)計(jì)中得出，五組小鼠在靶象限的時(shí)間分別為：空白組49.12%，模型組23.53%，嗅三針組39.54%，鹽酸多奈哌齊組37.13%，嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組19.97%。五組比較結(jié)果顯示嗅三針組成績(jī)最好。

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)靶象限時(shí)間

注：與空白組比較， *P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3 各組小鼠海馬APP、 Aβ蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖1、2，表3、4。通過(guò)對(duì)大鼠海馬區(qū)APP蛋白、Aβ蛋白的檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于APP蛋白、Aβ蛋白的表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，AD模型組小鼠的APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)顯著增高，具有顯著性差異(P<0.01)；與AD模型組比較，“嗅三針”干預(yù)組小鼠的APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與AD模型組比較，“嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組”的APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；與AD模型組比較，鹽酸多奈哌齊組小鼠的APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；嗅三針組與鹽酸多奈哌齊組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖1 各組小鼠海馬APP蛋白表達(dá)

圖2 各組小鼠海馬Aβ蛋白表達(dá)

組 別n海馬APP(比值)空白組1048.35±6.87模型組1082.98±8.12*嗅三針組1056.27±7.52#嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組1078.36±6.57鹽酸多奈哌齊組1059.56±7.13#

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

表4 各組小鼠海馬Aβ蛋白表達(dá)

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

討 論

研究表明，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein ，Aβ)的沉積和累積所引起的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致AD的基本病因之一。Aβ沉積導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia，MG)在淀粉樣斑塊周?chē)罅糠植疾⒒罨?進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),分泌具有細(xì)胞毒性的炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或死亡，加速AD的發(fā)展[7-8]。

嗅覺(jué)功能減退是AD早期主要的臨床癥狀之一，且癥狀持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)[9]，AD的病情具有不可逆性且病程較長(zhǎng)，而目前臨床上對(duì)其中晚期的治療效果較差，所以為了延緩其病情的進(jìn)展或預(yù)防其發(fā)病，早期的干預(yù)治療具有重要意義。“嗅三針”療法是課題組多年來(lái)用于治療AD和嗅覺(jué)功能障礙的一種特色電針療法[10]，由雙側(cè)迎香和印堂三穴配穴組成，二穴功能主治均與嗅覺(jué)系統(tǒng)密切相關(guān)，故命名為“嗅三針”。前期臨床及基礎(chǔ)研究應(yīng)用“嗅三針”方法治療AD，均取得良好的療效。有鑒于此，為了進(jìn)一步明確嗅三針對(duì)AD的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)影響相關(guān)調(diào)控環(huán)節(jié)提高嗅三針療效延緩AD發(fā)展進(jìn)程，本研究擬通過(guò)切斷和保留嗅覺(jué)通路，觀察嗅三針對(duì)AD小鼠空間記憶能力和海馬APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)的影響。

對(duì)于小鼠空間記憶能力的評(píng)估，我們采用Morris水迷宮測(cè)試中的空間探索試驗(yàn),Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前應(yīng)用最廣泛并得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)可，用來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[11]。研究結(jié)果表明：對(duì)于空間探索試驗(yàn)各指標(biāo)，嗅三針組和鹽酸多奈哌齊組與空白組比較無(wú)顯著性差異，與模型組比較有顯著性差異，說(shuō)明嗅三針組和鹽酸多奈哌齊組的干預(yù)對(duì)AD模型小鼠的記憶能力起到了改善作用，但還不能認(rèn)為嗅三針和鹽酸多奈哌齊使AD模型小鼠的記憶能力恢復(fù)到正常鼠水平，這可能與小鼠空間搜索策略之間具有一定的相關(guān)性，對(duì)于空白組小鼠，其在空間平臺(tái)位置記憶方面表現(xiàn)較好，而當(dāng)其跨越原平臺(tái)位置多次后，仍未找到空間平臺(tái), 小鼠對(duì)其記憶能力開(kāi)始懷疑并進(jìn)行其他方式的新探索；嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組與模型組比較無(wú)顯著性差異，說(shuō)明嗅三針加嗅神經(jīng)切斷組干預(yù)后小鼠的記憶能力沒(méi)有得到改善，提示嗅三針發(fā)揮改善AD小鼠記憶能力的作用是基于嗅覺(jué)通路完整性的基礎(chǔ)之上的。

對(duì)于小鼠海馬APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)，研究結(jié)果表明：嗅三針干預(yù)組可以顯著減少海馬區(qū)APP蛋白、Aβ蛋白的表達(dá)，效應(yīng)與鹽酸多奈哌齊組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明嗅三針干預(yù)AD小鼠的可能作用機(jī)制之一是通過(guò)減輕小鼠海馬區(qū)APP蛋白、Aβ蛋白的表達(dá)，改善小鼠空間記憶能力；嗅覺(jué)神經(jīng)切斷組即使在嗅三針的干預(yù)下也并沒(méi)有減少APP蛋白、Aβ蛋白在嗅神經(jīng)切斷后，干預(yù)效應(yīng)不顯現(xiàn)，說(shuō)明嗅三針通過(guò)激活嗅覺(jué)通路發(fā)揮對(duì)APP蛋白、Aβ蛋白的干預(yù)效應(yīng)，且嗅三針干預(yù)效應(yīng)的發(fā)揮有賴于嗅覺(jué)通路的完整性。

鹽酸多奈哌齊是目前臨床上對(duì)AD有較好治療效果的藥物，且安全性較高[12]，而在本實(shí)驗(yàn)研究中，“嗅三針”刺激與鹽酸多奈哌齊灌胃干預(yù)均能改善AD小鼠空間記憶能力并發(fā)揮對(duì)海馬APP蛋白、Aβ蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)，兩者相比，無(wú)顯著性差異。有鑒于此，我們認(rèn)為“嗅三針”通過(guò)激活嗅覺(jué)通路發(fā)揮以上干預(yù)效應(yīng)，且其發(fā)揮有賴于嗅覺(jué)通路的完整性，這可能是嗅三針干預(yù)AD小鼠的機(jī)制之一，但對(duì)其影響嗅覺(jué)系統(tǒng)功能的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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