楊嘉穎,趙胤安,宋 欣,彭美琪，陳霜霜,賈 佳

蘇州大學(xué)藥學(xué)院(蘇州215123)

·基礎(chǔ)研究·

氯硝柳胺抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥作用研究*

楊嘉穎,趙胤安,宋 欣,彭美琪，陳霜霜,賈 佳?

蘇州大學(xué)藥學(xué)院(蘇州215123)

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371278)

國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510285048Z)

?通訊作者

目的：探討氯硝柳胺對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥作用的影響。方法：建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2炎癥反應(yīng)模型；采用Griess法檢測細(xì)胞上清中NO釋放量，MTT法檢測細(xì)胞活性；實(shí)時(shí)定量 PCR (qPCR)檢測促炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的表達(dá)量。分析氯硝柳胺對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的影響。結(jié)果：氯硝柳胺能夠顯著抑制LPS激活的BV2細(xì)胞中NO釋放量；qPCR 結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞組相比，LPS組BV2中促炎因子的表達(dá)水平明顯升高；氯硝柳胺顯著降低LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中促炎因子表達(dá)。結(jié)論：氯硝柳胺對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用。

近年大量研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥損傷參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展。異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活后表現(xiàn)為促炎癥狀態(tài)，即M1表型，釋放白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞促炎癥因子介導(dǎo)神經(jīng)炎癥，造成腦組織功能和器質(zhì)性損傷。氯硝柳胺(Nclosamide)，化學(xué)名5,2’-二氯-4’-硝基-水楊乙酰苯胺，該藥物首次在1958年第六屆國際熱帶醫(yī)學(xué)與瘧疾大會(huì)上首次被報(bào)導(dǎo)，之后用于多種疾病的治療。研究顯示，氯硝柳胺在許多疾病模型中具有抑制炎癥的作用，如子宮內(nèi)膜異位癥模型[1]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型[2]等。然而，氯硝柳胺是否參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)目前未有報(bào)道。本研究以LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞為炎癥模型，探討氯硝柳胺對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

材料與方法

1 材 料 DEME培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)；LPS及氯硝柳胺(美國 Sigma 公司)；MTT(碧云天生物科技有限公司)；RNAiso Plus，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green (寶生物工程有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 BV-2細(xì)胞培養(yǎng)：含有10%胎牛血清以及1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)皿置于溫度為37 ℃以及一氧化氮含量為5%的環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞面積占據(jù)培養(yǎng)皿80%時(shí)可以被用來做實(shí)驗(yàn)。

2.2 NO含量測定：用Griess試驗(yàn)檢測培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的濃度來評(píng)估NO的含量,根據(jù)NO溶于水后形成亞硝酸鹽的原理。小膠質(zhì)細(xì)胞在有或沒有LPS(100 ng/ml, Sigma)刺激的情況下培養(yǎng)24 h。從4 ℃冰箱中取出A、B液，置于室溫下平衡30 min。繪制亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測樣本上清加入96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入50μl樣品。加入A液50μl，室溫避光孵育10 min；之后加入B液50μl，避光孵育10 min，在30 min內(nèi)利用酶標(biāo)儀在550 nm波長處測量吸光率，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出亞硝酸鹽含量。

2.3 MTT法測細(xì)胞活力：將狀態(tài)良好的BV2細(xì)胞以1×104/孔的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入50μl質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的MTT溶液，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。2 h后，棄孔內(nèi)液體，每孔加入500μl的DMSO，置于脫色搖床上低速震蕩以使結(jié)晶物充分溶解。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀中檢測570 nm條件下的吸光率，以此定量反映細(xì)胞的活性。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)：收集BV-2細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入1 ml Trizol，用移液槍輕輕混勻并吹下細(xì)胞至離心管，室溫靜置5 min，參照Takara公司Trizol試劑說明步驟提取BV-2細(xì)胞中的總RNA。用Nanodrop檢測RNA的濃度，將濃度單位設(shè)定為ng/μl，取1 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，采用Takara公司生產(chǎn)的RT-PCR 反應(yīng)試劑盒配置混合物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA樣品稀釋，將引物、DEPC水和SYBR Green混合，配置混合液。96孔板劃分對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，每孔中加入1.5μl cDNA與8.5μl混合液，封膜，上機(jī)，在ABI StepOnePlus PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s (×40 cycles)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用Sigma Scan統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩獨(dú)立組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間用one-way ANOVA 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列表

結(jié) 果

1 氯硝柳胺抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NO釋放 LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的NO參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥損傷，利用Griess法檢測不同濃度氯硝柳胺處理LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞上清中NO的釋放量。結(jié)果如圖1所示：溶劑對(duì)照組中單純用LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放量呈現(xiàn)多組中的最高值。實(shí)驗(yàn)組分為五組，氯硝柳胺濃度呈倍數(shù)遞增，結(jié)果顯示，NO的釋放量在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性：當(dāng)氯硝柳胺濃度為1.5256μM時(shí)，與對(duì)照組相比NO釋放量降低不明顯；當(dāng)氯硝柳胺濃度為3.125～25μM時(shí)，NO釋放量顯著降低，呈濃度依賴性，且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)氯硝柳胺濃度為50μM時(shí)，NO釋放量與前一組氯硝柳胺濃度為12.5μM相比基本持平，與對(duì)照組相比，差異明顯且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，氯硝柳胺能夠抑制LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞NO的釋放，并且氯硝柳胺的最適濃度在12.5～25μM之間。

2 氯硝柳胺對(duì)BV-2細(xì)胞活力的影響 為明確氯硝柳胺對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞NO釋放量的抑制作用不是由于其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用所致，我們通過MTT法檢測了化合物對(duì)LPS處理的BV-2細(xì)胞的細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示，與未加LPS組相比，濃度范圍為1.5256～50μM氯硝柳胺作用于LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活力無顯著影響。

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖1 NO釋放量測定圖

圖2 MTT細(xì)胞活力測定圖

3 氯硝柳胺明顯降低LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的表達(dá) 激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能釋放大量炎癥介質(zhì)，如iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6等。為了探究氯硝柳胺是否有抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的作用，利用q-PCR技術(shù)，檢測LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞上清中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)量。結(jié)果如圖3所示：未加入LPS處理時(shí)，對(duì)照組和單獨(dú)給藥處理組相關(guān)促炎因子mRNA表達(dá)水平很低，而給予LPS刺激后，iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯增高。氯硝柳胺(25μM)處理能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞上清中這四種促炎因子的mRNA表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明氯硝柳胺對(duì)LPS激活的BV-2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答具有抑制作用。

與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01

討 論

神經(jīng)退行性病變是一類主要由于神經(jīng)元死亡，突觸丟失[3]導(dǎo)致的一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如阿爾茲海默癥(Alzheimer disease, AD)、帕金森病(Parkinson disease, PD)、亨廷頓舞蹈癥(HD)、肌萎縮性側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等。疾病的主要病理表現(xiàn)為神經(jīng)元的過度凋亡和(或)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能障礙。 根據(jù)目前研究進(jìn)展，關(guān)于神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制較多，例如自由基引起的氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙、死亡受體途徑和線粒體途徑介導(dǎo)[4-5]的細(xì)胞凋亡[6]及炎癥等。破壞的血腦屏障[7]、隨循環(huán)系統(tǒng)入腦的外周免疫細(xì)胞與神經(jīng)毒性因子、激活的膠質(zhì)細(xì)胞[8]成為神經(jīng)炎癥的三個(gè)基本原因。神經(jīng)炎癥是腦部抵御神經(jīng)元損傷以及感染性物質(zhì)的重要防御機(jī)制[9]。

一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一種非經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠作為逆信使參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的信息傳遞[10]。腦組織中過量的一氧化氮具有神經(jīng)毒性作用，能夠誘導(dǎo)多種類型的神經(jīng)元凋亡。過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxidase，iNOS)，能夠促使腦組織中的L-精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐谎趸?，增加谷氨酸的毒性損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯硝柳胺能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS mRNA的表達(dá)，說明其具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。氯硝柳胺能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放量：當(dāng)氯硝柳胺濃度為3.125～25μM時(shí)，NO釋放量顯著降低且呈濃度依賴性。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)中含量最豐富的單核-巨噬細(xì)胞，約占細(xì)胞總數(shù)的10%。它的存在有利于維持神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)，并且在神經(jīng)炎癥過程中占有重要地位[12]。靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀，其豐富的軸突與樹突使其與星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元以及血管之間建立聯(lián)系，形成一張巨大的網(wǎng)絡(luò)覆蓋整個(gè)腦區(qū)，并對(duì)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起到一定得監(jiān)視作用。一旦中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷和(或)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速由分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆?，伸出偽足以覆蓋更多區(qū)域，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一系列病理生理過程[11]。小膠質(zhì)細(xì)胞受LPS、IFN-γ等持續(xù)刺激異常激活后表現(xiàn)為促炎癥狀態(tài)，即M1表型，釋放大量的炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)并加重神經(jīng)元的損害以及導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)未加入LPS處理時(shí)，對(duì)照組和單獨(dú)給藥處理組相關(guān)促炎因子mRNA表達(dá)水平很低，而給予LPS刺激后，iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯增高。而氯硝柳胺(25μM)處理能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞上清中這四種促炎因子的mRNA表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明氯硝柳胺對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放有一定抑制作用。然而，持續(xù)激活的細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害有一定的保護(hù)以及修復(fù)作用，清除錯(cuò)構(gòu)蛋白等。Shinjo R 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元華勒變性后，M1極化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)其軸索再生。在阿爾茲海默癥模型中，M1極化的小膠質(zhì)細(xì)胞有利于清除大腦中已經(jīng)存在的淀粉樣蛋白斑[14]。氯硝柳胺被證實(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放有一定抑制作用，由于只是初步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，未能在動(dòng)物模型上驗(yàn)證氯硝柳胺是否真正能夠抑制神經(jīng)炎癥，以及藥物作用是否是利大于弊仍然有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

同時(shí)氯硝柳胺是一種NF-κB抑制劑。NF-κB信號(hào)通路在神經(jīng)退行性疾病中具有重要地位，它能夠調(diào)節(jié)一系列炎癥因子的產(chǎn)生，如:iNOS、TNF-α、IL-6、COX-2等[15]。最新研究顯示，蜜環(huán)菌提取物作用于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞模型上，明顯降低p56的磷酸化水平，阻斷NF-κB信號(hào)通路，并且炎性介質(zhì)表達(dá)均有所下調(diào)[16]。由此可見，NF-κB信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中具有重要作用。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺(25μM)處理能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞上清中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明氯硝柳胺能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，提示NF-κB信號(hào)通路極有可能參與其中，這為我們下一步探討氯硝柳胺在小膠質(zhì)細(xì)胞參與的神經(jīng)退行性疾病中的機(jī)制研究提供了一定思路。

作為一種驅(qū)蟲藥，氯硝柳胺的臨床價(jià)值不斷提高。研究顯示，氯硝柳胺在許多動(dòng)物模型中具有抑制炎癥的作用。Genna R等將氯硝柳胺用于子宮內(nèi)膜異位癥的研究中，發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺有抑制異常細(xì)胞增殖并且抑制炎癥反應(yīng)的作用，主要通過影響NF-κB與STAT3的激活[1]。Liang L等的研究顯示，氯硝柳胺能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥作用，下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并且阻斷TNF-α介導(dǎo)的IKK, IκBα的磷酸化[2]。我們的研究表明氯硝柳胺對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷有顯著抑制作用，為下一步探索其參與中樞神經(jīng)炎癥作用和具體抗炎作用機(jī)制提供一定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于為神經(jīng)退行性疾病提供新的治療思路。

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(收稿：2017-04-18)

Anti-inflammatoryeffectsofNiclosamideinlipopolysaccharidestimulatedmicroglia

Yang Jiaying, Zhao Yin’an, Song Xin, et al.

College of Pharmaceutical Sciences, Suzhou University (Suzhou 215123)

Objective: To explore the inflammatory effects of Niclosamide in microglia stimulated by lipopolysaccharide. Methods: The effects of Niclosamide on inflammation were observed in BV-2 microglia stimulated by LPS. Nitric oxide production from microglia was assessed by measuring the nitrite concentration in the culture medium using Griess reagent. The cell viability was determined by MTT test. The production of pro-inflammatory factors containing inducible NO synthase(iNOS)，tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) and interleukin-6(IL-6)were examined by q-PCR. To analyze whether Niclosamide has effects on the inflammation of microglia. Results: Niclosamide significantly inhibited the release of NO from BV-2 microglia stimulated by LPS. qPCR results showed that Niclosamide remarkably decreased the mRNA expression of pro-inflammatory factors in activated BV-2 microglia induced by LPS.Conclusion: Niclosamid has an anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide stimulated microglia.

Inflammation Niclosamide/pharmacology Microglia Lipopolysaccharides

炎癥 氯硝柳胺/藥理學(xué) 神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞 脂多糖類

R967

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.001