肖海芳，楊淑青，王旭光，王 靜，宋元達(dá),*

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物體的正常代謝產(chǎn)物，主要存在于細(xì)胞線粒體中。適量ROS對于維持機(jī)體細(xì)胞正常的生理功能至關(guān)重要。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激和疾病狀態(tài)時，體內(nèi)ROS生成增多，過多的ROS攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子，進(jìn)而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、炎癥、癌癥和動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生[1-5]。

蛋白氧化已成為反映和衡量生命過程中氧化應(yīng)激和氧化損傷的重要手段[6]。蛋白發(fā)生降解以及蛋白羰基的形成是蛋白氧化的主要特征[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)許多疾病如阿爾茨海默癥、糖尿病、心腦血管等均與蛋白羰基化水平升高有關(guān)[9-12]。蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基酸（尤其是脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸）被氧化后發(fā)生羰基化；自由基通過α-酰胺途徑和谷?；鶜埢趸緩秸T導(dǎo)蛋白質(zhì)肽鏈發(fā)生氧化斷裂，生成蛋白羰基化衍生物；半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基的親核側(cè)鏈與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物醛類物質(zhì)（如4-羥基壬烯醛、丙二醛和2-丙烯醛）及還原糖反應(yīng)產(chǎn)物活性羰基衍生物的二級反應(yīng)也會產(chǎn)生羰基化合物[13]。目前，蛋白質(zhì)羰基化水平是應(yīng)用最多、最廣泛的蛋白氧化指標(biāo)[14-15]。檢測蛋白羰基水平的方法很多，其中較為靈敏的方法是采用二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）對羰基進(jìn)行衍生，形成穩(wěn)定的2,4-二硝基苯基腙，該物質(zhì)能夠吸收紫外光，因此可通過分光光度法進(jìn)行檢測[16]。另外，還可采用特異性Anti-DNP抗體，通過免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白羰基表達(dá)[17]。

食用植物中存在的天然抗氧化劑對于預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病具有重要意義。菊苣酸作為天然多酚類化合物，已被證明能夠清除自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[18]。然而目前仍未見從生物大分子角度探討菊苣酸抗氧化作用的報(bào)道。因此，本研究采用Cu2+/H2O2和2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）兩種不同的自由基誘導(dǎo)體系，分別產(chǎn)生羥自由基和烷氧自由基，誘導(dǎo)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、小鼠肝臟蛋白和腦蛋白3 種蛋白模型氧化損傷，探討菊苣酸對蛋白質(zhì)氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級雄性昆明小鼠20 只，體質(zhì)量（20±2）g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2007-001。

考馬斯亮藍(lán)R250 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀測定（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液 碧云天生物技術(shù)研究所；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、硫酸鏈霉素 科邦生物有限公司；DNPH、三羥甲基氨基甲烷 美國Amresco公司；二抗 美國Santa Cruz公司；0.45 μm孔徑聚偏二氟乙烯（polyvinylidene chloride film，PVDF）膜 美國Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（electrical chemiluminescence immunoassay，ECL） 美國Thermo Fisher公司；甘氨酸 德國Merck公司；菊苣酸（純度≥98%）、BSA、AAPH、Anti-DNP抗體 美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DY89-Ⅱ型勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；5419R型高速離心機(jī)、移液槍 德國Eppendorf公司；PowerPac 220V電泳供電裝置、165-8001型垂直電泳槽、221BR型Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽、ChemiDox XRS凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；-80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型萬分之一天平 德國Sartorius公司；VORTEX-5型漩渦混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；QYC110臺式恒溫振蕩器 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；生化分析型超純水機(jī) 成都優(yōu)普凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織蛋白的提取

本實(shí)驗(yàn)中所有動物的處理，遵循山東理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動物管理辦法的規(guī)定。小鼠于20～22 ℃、相對濕度45%～50%條件下飼養(yǎng)，以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前將小鼠禁食過夜，次日頸椎脫臼處死，迅速取出肝臟組織和腦組織，置4 ℃生理鹽水中反復(fù)漂洗，剔除脂肪及結(jié)締組織，用濾紙吸干水分。稱取0.1 g肝臟或腦組織，迅速剪碎，置于玻璃勻漿器中，加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液及10 μL PMSF溶液，冰水浴中勻漿，繼續(xù)裂解10 min，然后于4 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液，即為組織總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定組織總蛋白濃度。

1.3.2 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)蛋白氧化損傷的影響

Cu2+與H2O2反應(yīng)能夠產(chǎn)生羥自由基，引起蛋白質(zhì)氧化[6]。取0.6 mg/mL的BSA溶液（以100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液溶解）或組織蛋白（肝臟組織和腦組織）放入多支1.5 mL的離心管中，向?qū)嶒?yàn)組離心管中分別加入不同濃度的菊苣酸溶液，混合均勻。封口膜封口后置于37 ℃水浴中孵育，30 min后取出，分別向各離心管中加入一定濃度的H2O2和CuSO4溶液，使其終濃度分別為25 mmol/L和0.1 mmol/L；對照組不加H2O2和CuSO4溶液，以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替。將各離心管于37 ℃水浴中繼續(xù)孵育，90 min后分別檢測各蛋白樣品氧化損傷程度。

1.3.3 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)蛋白氧化損傷的影響

蛋白樣品與菊苣酸的孵育方法同1.3.2節(jié)。將AAPH溶液置于37 ℃水浴2 min，使其熱分解。實(shí)驗(yàn)組分別向各孵育后的樣品中加入一定體積濃度為500 mmol/L的AAPH溶液，使其終濃度為50 mmol/L；對照組不加AAPH溶液，以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替。將各樣品于37 ℃水浴鍋中繼續(xù)孵育4 h，分別檢測蛋白樣品氧化損傷程度。

1.3.4 SDS-PAGE檢測蛋白損傷程度

分別向1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)處理好的蛋白樣品中加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，混勻，置于95 ℃水浴中反應(yīng)10 min，使蛋白變性。取等量各變性后的蛋白樣品，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）90 min后，置于0.1%考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色30 min，脫色后采用ChemiDox凝膠成像系統(tǒng)對膠片成像，Quantity One軟件對條帶灰度進(jìn)行半定量分析。

1.3.5 Western blot檢測蛋白羰基化水平

分別取1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)處理好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，方法同1.3.4節(jié)。電泳結(jié)束后，剝離凝膠，于電轉(zhuǎn)槽中恒壓10 V半干式轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜放入2 mol/L的鹽酸溶液中浸泡10 min，再將其放入20 mmol/L的DNPH鹽酸溶液中衍生30 min。洗滌數(shù)次后將膜置于5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫封閉2 h。TBST洗膜數(shù)次后，將膜放入稀釋的Anti-DNP一抗中孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌后放入稀釋的二抗中，室溫輕搖孵育2h。上述PVDF膜經(jīng)TBST洗滌后采用ECL發(fā)光液于ChemiDox凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One軟件對條帶灰度進(jìn)行半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ±s表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan’s多重比較分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣酸對BSA氧化損傷的影響

2.1.1 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA氧化損傷的影響

圖1 菊苣酸對Cu2/誘導(dǎo)BSA氧化損傷的影響（SDS-PAGE檢測）Fig. 1 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced oxidative damage to BSA (detected by SDS-PAGE)

與對照組相比，BSA經(jīng)Cu2+/H2O2單獨(dú)誘導(dǎo)后，圖1中BSA條帶明顯變淺（P＜0.01），圖2中BSA羰基化水平明顯升高（P＜0.01），說明Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系產(chǎn)生的羥自由基使BSA發(fā)生明顯的氧化降解和羰基化修飾。與Cu2+/H2O2單獨(dú)處理組相比，菊苣酸預(yù)先孵育組的BSA條帶灰度明顯升高（P＜0.01），羰基化水平明顯下降（P＜0.01），并且濃度越高，菊苣酸的作用效果越顯著；其中，1 000 μmol/L菊苣酸幾乎能夠完全抑制Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA氧化損傷。以上結(jié)果說明，100～1 000 μmol/L菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA氧化損傷具有保護(hù)作用。

圖2 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導(dǎo)BSA羰基化的影響（Western blot檢測）Fig. 2 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced carbonylation of BSA (detected by Western blot)

2.1.2 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)BSA氧化損傷的影響

圖3 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)BSA氧化損傷的影響（SDS-PAGE檢測）Fig. 3 Effect of chicoric acid on AAPH-induced oxidative damage to BSA (detected by SDS-PAGE)

圖4 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)BSA羰基化的影響（Western blot檢測）Fig. 4 Effect of chicoric acid on AAPH-induced carbonylation of BSA(detected by Western blot)

在不同的誘導(dǎo)體系中抗氧化物的活性存在差異，為進(jìn)一步探討菊苣酸在其他誘導(dǎo)體系中對BSA氧化損傷的影響，本實(shí)驗(yàn)采用熱分解的含氮化合物AAPH誘導(dǎo)BSA發(fā)生氧化損傷。由圖3可見，經(jīng)50 mmol/L AAPH單獨(dú)誘導(dǎo)后，大部分BSA被氧化降解；由圖4可見，與對照組相比，BSA羰基化水平也明顯升高（P＜0.01），說明AAPH能夠誘導(dǎo)BSA氧化損傷。采用10～1 000 μmol/L菊苣酸預(yù)處理后：由圖3可見，BSA蛋白條帶灰度與AAPH單獨(dú)處理組相比明顯加深（P＜0.01）；由圖4可見，羰基化水平明顯下降（P＜0.01）；另外，隨著濃度的增加，其菊苣酸對BSA的作用效果越明顯。上述結(jié)果說明菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)的BSA氧化損傷也具有明顯的保護(hù)作用。

2.2 菊苣酸對小鼠組織蛋白氧化損傷的影響

動物肝臟和腦組織中蛋白含量較高，本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟蛋白和腦蛋白作為蛋白模型，以羰基化水平為檢測指標(biāo)，進(jìn)一步探討菊苣酸對組織蛋白氧化損傷的影響。

2.2.1 菊苣酸對小鼠肝臟蛋白氧化損傷的影響

2.2.1.1 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)小鼠肝臟蛋白氧化損傷的影響

圖5 菊苣酸對Cu2/誘導(dǎo)小鼠肝臟蛋白羰基化的影響Fig. 5 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation in mouse liver

蛋白羰基化條帶灰度越高，說明其氧化損傷程度越高。由圖5可以看出，Cu2+/H2O2單獨(dú)作用能引起肝臟蛋白羰基化水平的明顯升高。與Cu2+/H2O2單獨(dú)組相比，經(jīng)10～100 μmol/L菊苣酸預(yù)先孵育后，Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系中的小鼠肝臟蛋白羰基化水平無明顯變化，但500 μmol/L菊苣酸能明顯降低小鼠肝臟蛋白的羰基化水平；當(dāng)菊苣酸濃度增加為1 000 μmol/L時，小鼠肝臟蛋白的羰基化水平與其他各處理組相比均明顯升高。上述結(jié)果表明，菊苣酸在一定濃度范圍內(nèi)能夠?qū)u2+/H2O2誘導(dǎo)小鼠肝臟蛋白氧化損傷具有保護(hù)作用，但高濃度菊苣酸表現(xiàn)出促氧化作用。

2.2.1.2 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)小鼠肝臟蛋白氧化損傷的影響

由圖6可以看出，AAPH單獨(dú)處理后，小鼠肝臟蛋白的羰基化水平明顯升高。10 μmol/L菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)的小鼠肝臟蛋白羰基化修飾無明顯抑制作用，而菊苣酸在100～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)能夠有效抑制AAPH誘導(dǎo)小鼠肝臟蛋白羰基的產(chǎn)生，對小鼠肝臟蛋白氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，且菊苣酸濃度越高對AAPH誘導(dǎo)體系中小鼠肝臟蛋白的保護(hù)效果越好。

圖6 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)小鼠肝臟蛋白羰基化的影響Fig. 6 Effect of chicoric acid on AAPH-induced protein carbonylation in mouse liver

2.2.2 菊苣酸對小鼠腦蛋白氧化損傷的影響

2.2.2.1 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)小鼠腦蛋白氧化損傷的影響

圖7 菊苣酸對Cu2＋/小鼠腦蛋白羰基化的影響Fig. 7 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation in mouse brain

由圖7可以看出，與空白組相比，經(jīng)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系單獨(dú)處理的小鼠腦蛋白羰基化水平明顯升高。經(jīng)10、100 μmol/L菊苣酸預(yù)先孵育后，小鼠腦蛋白羰基化程度明顯下降，說明該濃度范圍內(nèi)菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系中的小鼠腦蛋白具有保護(hù)作用。當(dāng)菊苣酸濃度分別增加至500、1 000 μmol/L時，小鼠腦蛋白羰基化水平反而明顯升高，甚至超過Cu2+/H2O2單獨(dú)處理組。這一結(jié)果說明，在Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系中濃度過高的菊苣酸對小鼠腦蛋白表現(xiàn)出促氧化作用。

2.2.2.2 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)小鼠腦蛋白氧化損傷的影響

由圖8可見，經(jīng)終濃度為50 mmol/L的AAPH誘導(dǎo)后，小鼠腦蛋白羰基化程度明顯升高。濃度為10 μmol/L的菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)的小鼠腦蛋白羰基化無明顯抑制作用，但經(jīng)濃度分別為100、1 000 μmol/L的菊苣酸預(yù)先孵育后，小鼠腦蛋白的羰基化程度明顯下降。上述結(jié)果說明，在AAPH誘導(dǎo)體系中濃度為100～1 000 μmol/L菊苣酸表現(xiàn)出抗氧化作用，對小鼠腦蛋白具有明顯的保護(hù)作用。

圖8 菊苣酸對AAPH誘導(dǎo)小鼠腦蛋白羰基化水平的影響Fig. 8 Effect of chicoric acid on AAPH-induced protein carbonylation in mouse brain

3 討 論

Cu2+與H2O2反應(yīng)生成羥自由基，AAPH熱分解產(chǎn)生烷過氧自由基，兩種反應(yīng)體系均能誘導(dǎo)生物大分子蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷。大量研究顯示，天然抗氧化劑能夠抑制自由基對蛋白的氧化損傷[6,19-21]。本實(shí)驗(yàn)利用上述兩種典型的氧化誘導(dǎo)體系，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以BSA、小鼠肝臟蛋白和腦蛋白為蛋白模型，研究菊苣酸對蛋白質(zhì)氧化損傷的影響。

本研究結(jié)果表明，無論是通過SDS-PAGE觀察蛋白降解情況，還是Western blot檢測蛋白羰基化水平，菊苣酸在100～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)能夠抑制Cu2+與H2O2誘導(dǎo)體系對BSA的氧化損傷；低濃度菊苣酸對羥自由基引起的小鼠肝臟蛋白和腦蛋白氧化損傷具有保護(hù)作用，但在高濃度時菊苣酸表現(xiàn)出促氧化作用。與Cu2+/H2O2反應(yīng)體系不同，在AAPH誘導(dǎo)體系中，高濃度菊苣酸對BSA、小鼠肝臟蛋白和小鼠腦蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用。菊苣酸之所以在兩種反應(yīng)體系中表現(xiàn)出不同的作用效果，可能是由兩種體系中自由基的性質(zhì)及在生物大分子上的作用位點(diǎn)不同引起[22]。

據(jù)文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道，VC和VE分別與Cu2+共同作用，均能引起蛋白和DNA的氧化損傷；類黃酮類物質(zhì)能夠與過渡金屬反應(yīng)，加速羥自由基的生成[25-26]；高劑量注射VC后，豚鼠血清脂質(zhì)過氧化水平升高[27]。上述研究結(jié)果均表明，許多抗氧化劑在某些情況下能夠表現(xiàn)出促氧化效應(yīng)。在Cu2+與H2O2誘導(dǎo)體系中，高濃度菊苣酸對小鼠組織蛋白表現(xiàn)出促氧化作用，可能與Cu2+與H2O2反應(yīng)體系本身有關(guān)。Cu2+與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的原理為[28]：Cu2++H2O2→Cu++HO2·+H+，H2O2+Cu+→OH·+OH-+Cu2+。由反應(yīng)式能夠看出，Cu2+向Cu+的轉(zhuǎn)變是生成羥自由基的限速步驟，高濃度菊苣酸加入后可能促進(jìn)了Cu2+向Cu+的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而加速羥自由基的產(chǎn)生，促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化，這一推測有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。前期研究也曾發(fā)現(xiàn)，菊苣酸能夠誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[29]。另外，在Cu2+/H2O2誘導(dǎo)體系中，高濃度菊苣酸對BSA和小鼠組織蛋白表現(xiàn)出不同的作用效果，這一差異可能與小鼠組織蛋白的成分較為復(fù)雜有關(guān)。菊苣酸促氧化的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探討。

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