曾雪愛 ，周春權(quán) ，王秀峰 ，張一帆 ，黃俊山 （1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建省中醫(yī)睡眠醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

睡眠是機(jī)體復(fù)原、整合和鞏固記憶的重要環(huán)節(jié)，是維持生命所必須的過程，根據(jù)睡眠過程中腦電圖、眼球運(yùn)動(dòng)情況，睡眠可分為快速眼球運(yùn)動(dòng)（rapid eye movement，REM）和非快速眼球運(yùn)動(dòng)（non rapideye movement，NREM）兩個(gè)時(shí)相。其中 REM 睡眠亦稱異相睡眠（paradoxical sleep），它對(duì)于保證學(xué)習(xí)、記憶和情感等大腦高級(jí)功能正常具有非常重要的作用［1］。隨著生活節(jié)奏的加快和社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的增加，睡眠障礙或睡眠相關(guān)疾病的發(fā)生率逐年增加，越來越多的人處于慢性睡眠剝奪狀態(tài)。長(zhǎng)期睡眠不足或異相睡眠剝奪（paradoxical sleep deprivation，PSD）嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量、身心健康和學(xué)習(xí)記憶。松郁安神方是黃俊山教授臨床上治療失眠的經(jīng)驗(yàn)效方，臨床上用于治療失眠療效顯著。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)該方能改善REM睡眠剝奪所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降［2］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過檢測(cè)大鼠海馬學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵蛋白——cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的表達(dá)和變化，探討松郁安神方改善PSD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)3 d，給予充足食物和水。實(shí)驗(yàn)前將大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、PSD模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組5只。

1.2 主要藥品與試劑 RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq（大連TaKaRa公司）；細(xì)胞裂解液、PMSF（碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白 Marker（美國(guó) Thermo 公司）；一抗：CREB及 p-CREB（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）；GAPDH（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）；二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（美國(guó) SAB公司）；顯影液（美國(guó)Thermo公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。中藥松郁安神方由福建省中醫(yī)藥研究院提供。

1.3 主要儀器 睡眠剝奪裝置（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；7 500 fast型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；蛋白電泳和電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Alpha多色熒光、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）。

2 方 法

2.1 PSD模型建立 采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法建立模型［3］。每次取8只大鼠放入睡眠剝奪裝置內(nèi)，內(nèi)有9個(gè)小平臺(tái)，平臺(tái)直徑6.5 cm，平臺(tái)周圍注滿水，平臺(tái)高出水面約1.0 cm。當(dāng)大鼠進(jìn)入異相睡眠時(shí)，由于全身肌肉張力降低，出現(xiàn)垂頭觸水而覺醒，使動(dòng)物不能進(jìn)入異相睡眠，連續(xù)睡眠剝奪96 h。對(duì)照組采用與睡眠剝奪組一樣的裝置，只是把大鼠放在直徑為12.0 cm的大平臺(tái)上，在大平臺(tái)上的動(dòng)物能夠進(jìn)入異相睡眠，使其所處環(huán)境與其它組完全一致。2.2 給藥方法 睡眠剝奪第1天開始進(jìn)行灌胃給藥。松郁安神方由甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，丹參 15 g，酸棗仁 15 g，首烏藤 30 g，珍珠母30 g，生龍骨30 g，合歡皮 15 g組成，藥材加 10倍量的水浸泡30 min，珍珠母和生龍骨先煎30 min后，加入其余中藥，先武火煮沸，再文火煮30 min，過濾，殘?jiān)铀逯?，重?fù)2遍，合并濾液，濃縮至所需濃度。中藥高劑量組、中藥低劑量組分別按34 g／kg、17 g／kg體質(zhì)量灌胃給藥，對(duì)照組和PSD模型組均給予等體積蒸餾水，每天1次，共7 d。于第7天灌胃2 h后取材，在冰面上迅速分離海馬組織，-80℃冰箱保存。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 總RNA提取參照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的總RNA純度及完整性檢測(cè)后，選用天根Quant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。在進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)前，用普通PCR檢驗(yàn)引物的特異性，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×） 10 μL，50×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上下 游 引 物分別 為 1 μL，cDNA 模 板 7.5 μL，加DEPC水補(bǔ)至20 μL。PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 3 s，60℃延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.4 蛋白印跡法檢測(cè) 取海馬研磨，使組織細(xì)碎，加入裂解液，置于冰上裂解，勻漿液離心，采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定組織總蛋白含量。總蛋白按1∶1加入2×上樣緩沖液，混勻，變性處理后進(jìn)行蛋白印跡法檢測(cè)，其步驟大致如下：經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將膜放入5%脫脂奶粉封閉液置室溫?fù)u床上封閉 2 h，加一抗（CREB，兔抗，1∶500；p-CREB，兔抗，1∶500；GAPDH，兔抗，1∶1 000）于 4℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP）的二抗（羊抗兔 1∶5 000），二抗室溫?fù)u床上孵育 1 h，最后將膜正面朝上放置在顯影板上，曝光顯影。用AlphaView SA軟件分析光密度，根據(jù)光密度對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參光密度比值。將對(duì)照組的光密度比值設(shè)定為1，其余各組與對(duì)照組的比值作為最后結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 松郁安神方對(duì)PSD大鼠海馬CREB mRNA表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：連續(xù)睡眠剝奪96 h后，大鼠海馬CREB mRNA表達(dá)明顯降低，相對(duì)表達(dá)量為（0.63±0.10），與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同劑量松郁安神方干預(yù)后CREB mRNA表達(dá)明顯升高，并呈明顯的劑量效應(yīng)，中藥高劑量組相對(duì)表達(dá)量為（0.86±0.09），與模型組比較有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01），中藥低劑量組相對(duì)表達(dá)量為（0.75±0.08），差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖 1。3.2 松郁安神方對(duì)PSD大鼠海馬CREB蛋白表達(dá)的影響 蛋白印跡法結(jié)果顯示：連續(xù)睡眠剝奪96 h后，大鼠海馬磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表達(dá)降低，相對(duì)表達(dá)量為（0.63±0.03），與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥高、低劑量組干預(yù)后p-CREB表達(dá)明顯升高，中藥高劑量組相對(duì)表達(dá)量為（0.91±0.03），中藥低劑量組相對(duì)表達(dá)量為（0.78±0.09），與模型組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 4組PSD大鼠海馬CREB mRNA表達(dá)量比較

圖2 4組PSD大鼠海馬p-CREB蛋白表達(dá)量比較

4 討 論

在異相睡眠期，除眼肌和中耳肌外，其它肌肉尤其是頸后肌和四肢肌肉的張力極度下降，不能維持某種姿勢(shì)［3］，改良多平臺(tái)睡眠剝奪法是根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)。此外，為了避免水環(huán)境對(duì)動(dòng)物造成一定的應(yīng)激反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用大平臺(tái)進(jìn)行對(duì)照。大平臺(tái)的直徑允許大鼠進(jìn)入異相睡眠，其他環(huán)境均與小平臺(tái)相同。目前該方法是研究睡眠剝奪較常用且成熟的動(dòng)物模型建立方案。

學(xué)習(xí)記憶與睡眠是相互影響的過程，學(xué)習(xí)記憶能影響睡眠的結(jié)構(gòu)和時(shí)間，睡眠也可對(duì)覺醒時(shí)所獲信息進(jìn)行加工、整理并鞏固成長(zhǎng)時(shí)記憶，其中，異相睡眠與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系較大。有研究報(bào)道：異相睡眠剝奪對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力存在一定的損害，其學(xué)習(xí)和記憶的獲得與鞏固過程下降［4］；異相期睡眠剝奪可引起大鼠空間參考記憶能力低下［5］。

CREB是一種關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，在各系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要的作用，能調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性相關(guān)基因的表達(dá)［6］。很多與睡眠相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)可影響腦內(nèi)cAMP的含量［7］。當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合后，激活腺苷酸環(huán)化酶，水解生成第二信使cAMP，cAMP進(jìn)一步激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），即激活cAMP-PKA信號(hào)通路，CREB在神經(jīng)系統(tǒng)中通常作為許多信號(hào)通路的終止與交匯點(diǎn)，其調(diào)控的上下游信號(hào)分子及其靶基因和CREB一起參與了神經(jīng)細(xì)胞存活、再生、分化等過程，與突觸的可塑性和學(xué)習(xí)記憶等正常生理活動(dòng)密切相關(guān)［6，8］。 研究表明：睡眠剝奪阻礙海馬 cAMPPKA信號(hào)通路，可擾亂認(rèn)知過程［9］。對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究也表明：REM睡眠剝奪能降低海馬磷酸化CREB （P-CREB）水平［10］?？梢姾ｑR中磷酸化 CREB水平與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。

松郁安神方既能改善大鼠REM睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［2］，又能夠鎮(zhèn)靜安神，增加睡眠時(shí)間和深度，從而改善記憶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：REM睡眠剝奪96 h后，大鼠海馬CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表達(dá)均降低，這與之前的研究報(bào)道一致。松郁安神方干預(yù)后，能明顯升高海馬CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表達(dá)，提示松郁安神方改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能通過調(diào)節(jié)CREB而發(fā)揮作用。但該方是否進(jìn)一步調(diào)控CREB相關(guān)的信號(hào)通路，還有待于進(jìn)一步的研究。

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