李德森，王英豪，吳水生，劉清華，王河山

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

鉤吻又名斷腸草、山砒霜、野葛等，為馬錢科胡蔓藤屬植物胡蔓藤Gelsemium elegans Benth.的全株，因毒性巨大，民間一直以外用為主，主治濕疹、癰腫、體癬、跌打損傷、風濕痹痛、神經(jīng)痛等［1］。鉤吻毒性成分主要為吲哚類生物堿［2］，然吲哚類生物堿也有著獨特的生物活性，現(xiàn)代藥理實驗也表明其對腫瘤、疼痛、炎癥、免疫、皮膚病等的治療發(fā)揮著重要作用［3-5］。但由于其治療量和中毒量非常接近，安全指數(shù)較小，不乏中毒的臨床報道［6］，大大限制了鉤吻在臨床上的應用。因而，如何降低鉤吻的毒性，同時保持其藥理活性，對于提高鉤吻臨床應用的安全性具有十分重要的意義。本研究旨從配伍減毒角度闡明鉤吻減毒存效的有效方法。

1 材料

1.1 藥品與試劑 鉤吻堿甲對照品（由我院實驗室自制，氫譜、碳譜、核磁共振和質譜數(shù)據(jù)與文獻比較確認純度大于99.9%）；鉤吻（Gelsemium elegans）采自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地；玉葉金花（Mussaenda pubescens）生藥采自福建省福州市郊外；薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）、魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）購于福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂醫(yī)院。均經(jīng)福建中醫(yī)藥大學王河山老師鑒定。無水乙醇、醋酸鈉、冰醋酸、氯仿、溴甲酚綠等均為分析純。

1.2 實驗儀器 紫外-可見分光光度計（UV-9100型，北京瑞利分析儀器公司）；電子分析天平（FA20004N型，北京賽多利斯天平有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-52型，上海亞榮生化儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S型，上海錦屏儀器儀表有限公司）；中草藥粉碎機（FY135型，天津市泰斯特儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗動物 健康昆明種6～8周齡小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心代購，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

2 方 法

2.1 藥物制備

2.1.1 鉤吻水煎液制備 取同一植株鉤吻藥材干品 10 g，水煎煮 2次，每次 30 min，合并濾液，濃縮并轉移定容至10 mL，即得Ⅰ提取液，濃度為1 g／mL（以鉤吻生藥量計）。

2.1.2 鉤吻醇提液制備 取同一植株鉤吻藥材干品10 g，置圓底燒瓶中，乙醇回流提取2次，每次30 min，合并上清液，回收乙醇，減壓濃縮并轉移定容至 10 mL，即得Ⅱ提取液，濃度為 1 g·mL-1（以鉤吻生藥量計）。

2.1.3 鉤吻配伍玉葉金花液制備 取同一植株鉤吻藥材干品10 g、玉葉金花藥材干品10 g，水煎煮2次，每次30 min，合并濾液，濃縮并轉移定容至10 mL，即得Ⅲ提取液，濃度為 1 g·mL-1（以鉤吻生藥量計）。

2.1.4 鉤吻配伍魚腥草、薄荷液制備 取同一植株鉤吻藥材干品10 g、魚腥草藥材干品5 g、薄荷藥材干品5 g，水煎煮 2次，每次 30 min，合并濾液，濃縮并轉移定容至10 mL，即得Ⅳ提取液，濃度為1 g／mL（以鉤吻生藥量計）。

2.1.5 缺鉤吻藥材的中藥液制備 稱取玉葉金花藥材干品 10 g，水煎煮 2次，每次 30 min，合并濾液，濃縮并轉移定容至10 mL，即得Ⅴ提取液，濃度為1 g／mL（以玉葉金花生藥量計）；稱取魚腥草藥材干品5 g、薄荷藥材干品 5 g，水煎煮2次，每次30 min，合并濾液，濃縮并轉移定容至10 mL，即得Ⅵ提取液，濃度為1 g／mL（以魚腥草、薄荷生藥量計）。2.2 鉤吻不同配伍方式總生物堿的含量測定

2.2.1 標準曲線建立 參照文獻［7］中的方法，精密稱取鉤吻堿甲對照品約0.01 g，加入少量1 mol／L HCl溶解，用無水乙醇定容于10 mL容量瓶中，搖勻；分別精密吸取此對照品溶液 10、15、30、50、60 μL置于分液漏斗中，揮干乙醇，然后分別加入pH為4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5.0 mL，加入0.5 mL溴甲酚綠酸性染料溶液，搖勻；加入7.0 mL氯仿萃取，在40 min時終止反應，將氯仿層放出，在410 nm處測定吸光度，進行線性回歸分析建模。

2.2.2 鉤吻單煎液中總生物堿含量測定 分別精密移?、?、Ⅱ提取液各0.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1項下的方法顯色，測定吸光度值，計算總生物堿含量。

2.2.3 鉤吻不同配伍液中總生物堿含量測定 分別精密移?、蟆ⅱ籼崛∫焊?.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1項下的方法顯色，測定吸光度值，計算總生物堿含量。

2.2.4 缺鉤吻藥材提取液的干擾吸收研究 分別精密移?、酢ⅱ鎏崛∫焊?.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1項下的方法顯色，測定吸光度值，以確定是否存在干擾吸收。

2.3 鉤吻不同配伍方式的小鼠急性毒性研究

2.3.1 急性毒性預試驗 目的在于先確認引起100%死亡率（Dm）的劑量。取小鼠16只，隨機分成4 組，每組 4 只，禁食 24 h，自由飲水。按 4、2、1、0.5 g／kg的劑量分別給4組小鼠一次性灌胃給藥鉤吻水煎液。觀察并記錄小鼠24 h內(nèi)的中毒癥狀和死亡情況。

2.3.2 急性毒性試驗 將24只小鼠隨機分成3組：鉤吻組（給藥劑量為預試Dm劑量，下同）、鉤吻配玉葉金花組、鉤吻配魚腥草、薄荷組，每組8只。用苦味酸標記，試驗前禁食不禁水24 h，然后將各組小鼠按照2.3.1中計算所得的劑量進行一次性灌胃給藥。觀察并記錄小鼠24 h內(nèi)的中毒癥狀和死亡情況。

2.4 鉤吻配伍玉葉金花的減毒存效研究

2.4.1 鉤吻不同配比玉葉金花對總生物堿含量的影響 參照2.1.3項“鉤吻配伍玉葉金花液制備”分別制備鉤吻∶玉葉金花 1∶2、1∶3 提取液，分別得濃度為1 g／mL的Ⅶ、Ⅷ水提液（均以鉤吻生藥量計）。總生物堿含量測定：分別精密移?、瘛ⅱ?、Ⅶ、Ⅷ提取液0.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1項下的方法顯色，測定吸光度，計算總生物堿含量。

2.4.2 鉤吻不同配比玉葉金花的急性毒性實驗將32只小鼠隨機分成4組：鉤吻組、鉤吻配玉葉金花 1∶1 組（配伍Ⅰ組）、鉤吻配玉葉金花 1∶2 組（配伍Ⅱ組）、鉤吻配玉葉金花1∶3組（配伍Ⅲ組），每組8只。用苦味酸標記，試驗前禁食不禁水24 h，然后將各組小鼠按0.875 g／kg給予Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ水提液進行一次性灌胃。觀察記錄小鼠24 h內(nèi)的中毒癥狀和死亡情況。

2.4.3 鉤吻不同配比玉葉金花的鎮(zhèn)痛實驗 將20只小鼠隨機分成4組：生理鹽水組、鉤吻組、配伍Ⅱ組、配伍Ⅲ組，每組8只。用苦味酸標記，鉤吻組、鉤吻配玉葉金花組分別按0.5 g／kg灌胃給藥，1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.1 mL／10 g。觀察并記錄注射醋酸溶液后15 min內(nèi)小鼠因疼痛扭體的次數(shù)。

圖1 鉤吻堿甲標準曲線圖

3 結 果

3.1 鉤吻不同配伍方式總生物堿的含量測定

3.1.1 標準曲線繪制 以鉤吻堿甲對照品含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程：Y＝0.0233X＋0.2228（r＝0.999 0）。 結果表明當鉤吻堿甲對照品含量在10～60 μg，吸光度與對照品含量呈現(xiàn)良好的線性關系。

3.1.2 不同配伍方式總生物堿的含量測定 鉤吻單煎液、不同配伍液中總生物堿的含量測定結果顯示：鉤吻配伍魚腥草、薄荷總生物堿含量較醇提液有所降低；鉤吻配伍玉葉金花后總生物堿含量較鉤吻水煎液、醇提液均明顯降低，而缺鉤吻藥材的提取液幾乎沒吸收?？梢?，鉤吻不同配伍方式均可在一定程度上降低其總生物堿含量，尤其是鉤吻配伍玉葉金花。結果見圖2。

圖2 不同配伍方式鉤吻總生物堿含量測定

3.2 鉤吻不同配伍方式的小鼠急性毒性研究

3.2.1 急性毒性預實驗 急性毒性預試驗結果表明：鉤吻不同劑量給藥后，小鼠出現(xiàn)痙攣、驚厥、跳躍，最后呼吸衰竭而死，死亡時間均在給藥后0.5 h內(nèi)。當鉤吻劑量≥1 g／kg時，小鼠死亡率為100%，故確定鉤吻的Dm劑量為1 g／kg，進行下一步急性毒性實驗。

3.2.2 急性毒性實驗 鉤吻不同配伍的急性毒性試驗結果表明：小鼠給予鉤吻1 g／kg時，全部死亡，但鉤吻配伍玉葉金花、鉤吻配伍魚腥草、薄荷后，小鼠死亡率均下降至87.5%，且死亡時間亦明顯延長，與鉤吻組比較有顯著性差異（P＜0.05）。綜合3.1.2項下研究結果，選用鉤吻配伍玉葉金花進一步考察其減毒存效的研究。

表1 鉤吻的急性毒性預試驗

表2 鉤吻不同配伍的急性毒性試驗（x±s）

3.3 鉤吻配伍玉葉金花的減毒存效研究

3.3.1 不同配比對總生物堿的影響 鉤吻不同配比的總生物堿含量測定結果表明：鉤吻、玉葉金花合用，隨著配比的增加，總生物堿含量降低，見圖3。

圖3 不同配比對鉤吻總生物堿含量的影響

3.3.2 不同配比的急性毒性試驗 鉤吻不同配比的急性毒性結果表明：鉤吻、玉葉金花合用，隨著配比的增加，小鼠死亡率大幅降低，綜合3.3.1項結果可知，鉤吻配伍玉葉金花后可達到“減毒”作用。

表3 鉤吻不同配比的急性毒性試驗

3.3.3 不同配比的鎮(zhèn)痛試驗 鉤吻與玉葉金花不同配比組的鎮(zhèn)痛結果表明：給藥組與生理鹽水組比較，扭體次數(shù)顯著降低（P＜0.01或＜0.05），且鉤吻配伍玉葉金花（1∶2）組與鉤吻組小鼠醋酸扭體次數(shù)差異無顯著性（P＞0.05），表明鉤吻配伍玉葉金花后仍保留鎮(zhèn)痛作用，但鎮(zhèn)痛效果隨玉葉金花比例增加而減弱。

圖4 鉤吻與玉葉金花不同配比組小鼠醋酸扭體次數(shù)（x±s）

4 結 論

4.1 鉤吻分別配伍玉葉金花、薄荷與魚腥草后均可在一定程度上降低鉤吻總生物堿含量，降低小鼠死亡率，延長小鼠死亡時間，其中鉤吻配伍玉葉金花減毒作用尤為明顯。

4.2 鉤吻配比不同比例玉葉金花（1∶1、1∶2、1∶3）后，隨著配比的增加，總生物堿含量降低，小鼠死亡率亦大幅降低，達到“配伍減毒”的效果，且保留明顯的鎮(zhèn)痛作用，達到“存效”的效果。

4.3 中藥配伍減毒增（存）效是中醫(yī)藥學的特色和優(yōu)勢之一。鉤吻為劇毒植物，配伍玉葉金花后能減緩其毒性，保留其鎮(zhèn)痛藥效，但配伍解毒機制有待進一步深入探討。

參考文獻：

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