謝 飛 ，任冬梅

（1.內(nèi)蒙古大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.金河生物科技股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010200）

金河生物科技股份有限公司采用二級發(fā)酵工藝生產(chǎn)金霉素，其主要生產(chǎn)過程如下：將生產(chǎn)用菌保存在低溫沙土孢子管內(nèi)，然后將其接種到麩皮瓊脂斜面上，斜面在35℃條件下培養(yǎng)4.0~4.5 d（母子斜面）；將成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種于種子培養(yǎng)罐，使孢子發(fā)芽生長，繁殖大量菌絲后移入發(fā)酵罐培養(yǎng)，使其大量分泌次級代謝產(chǎn)物——金霉素。生產(chǎn)用培養(yǎng)基的主要成分為玉米淀粉、玉米漿、花生餅粉、蛋白胨及無機鹽等。培養(yǎng)基采用實罐滅菌法，在整個培養(yǎng)過程中嚴格保持無菌狀態(tài)以及一定的罐溫、罐壓，通入無菌空氣不斷攪拌。根據(jù)發(fā)酵代謝過程中的pH值及糖量變化，采用通氨補料工藝以保持一定的營養(yǎng)物質(zhì)含量及酸堿度，當菌絲接近自溶、濾速下降、發(fā)酵周期在80~120 h時放入提煉。

該工藝中利用的玉米淀粉生產(chǎn)流程見圖1。

圖1 玉米淀粉生產(chǎn)流程

該研究將金霉素發(fā)酵主要原料玉米淀粉，即圖1中成品淀粉替換為玉米淀粉乳即淀粉漿直接用于生產(chǎn)，這不僅節(jié)省了玉米淀粉生產(chǎn)過程中的淀粉分離和蛋白質(zhì)分離等工序，還可以在原料中帶入一定的蛋白質(zhì)供發(fā)酵使用，同時可以形成玉米淀粉生產(chǎn)和金霉素生產(chǎn)的不間斷一條龍工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金色鏈霉菌株3株，編號分別為：JHSW-13#、JHSW-28#、JHSW-44#，均由金河生物科技股份有限公司研發(fā)部菌種室提供，3株菌均是生產(chǎn)常用菌株。每株菌進行3次平行試驗，試驗發(fā)酵過程在研發(fā)部中試進行，設(shè)備儀器均由研發(fā)部中試提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 糖含量的檢測：利用金霉素標準品，采用梅特勒托利多MR40折光儀繪制金霉素標準曲線并保存在內(nèi)存中。取消后樣和發(fā)酵定時樣用單層濾紙過濾，用潔凈滴管取1~3 mL濾液置于折光儀樣品測定位置。選擇曲線進行測定并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 氨基氮含量的檢測：取消后樣和發(fā)酵定時樣用單層濾紙過濾，取濾液5 mL置于250 mL三角瓶中，加50 mL蒸餾水。加入2滴0.1%甲基紅和2滴2 mol/L硫酸，搖勻，反應液呈粉紅色。用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至黃色，加入10 mL 18%甲醛溶液靜置10 min。加入2滴0.04%酚酞指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至粉紅色，記錄消耗氫氧化鈉溶液體積，查表，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 磷含量的檢測：取消后樣和發(fā)酵定時樣用單層濾紙過濾，取濾液5 mL置于50 mL容量瓶中，加10%三氯乙酸10 mL，沸騰水浴鍋加熱5 min，冷卻，蒸餾水定容。將上述溶液用雙層定性濾紙過濾，取2 mL于25 mL容量瓶中，加入磷試劑Ⅰ、Ⅱ各1 mL，加水3 mL，沸騰水浴鍋內(nèi)加熱 3 min，取出冷卻，蒸餾水定容。利用722型分光光度計在600 nm波長下進行比色，記錄消光值。同時用蒸餾水作空白對照。查表求得單位，乘以5即得到溶磷含量。

1.2.4 菌濃的測定：發(fā)酵定時采樣，在15 mL離心管中加入10 mL（稱重）發(fā)酵液，在離心機中3 000 r/min離心10 min，倒出上清液，稱重。減去離心管重，再減去培養(yǎng)基重，與發(fā)酵液體積（10 mL）相比，乘以100%即得所求菌濃。培養(yǎng)基重測定方法：消后取樣10 mL加入離心管離心10 min，倒出上清液，稱重，減去離心管重，即為培養(yǎng)基重。

1.2.5 效價的測定：取發(fā)酵20 h后定時樣，用固體草酸酸化至pH值1.2~1.4，將酸化液用單層濾紙過濾。精確量取酸化濾液2 mL，加入適量蒸餾水按適當倍數(shù)稀釋，搖勻備用。分別吸取1 mL稀釋液置于2只50 mL容量瓶，一只加5 mL 2 mol/L鹽酸于沸騰水浴鍋加熱5 min，取出冷卻，蒸餾水定容；另一只作空白對照，加5 mL 2 mol/L鹽酸后，蒸餾水定容。利用722型分光光度計在440 nm波長下測定消光值。查表，計算得出效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 消后糖含量、溶磷含量及pH值

發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖是微生物主要的能量來源［1-2］。 玉米淀粉乳的干物質(zhì)含量為 39.79%［3］，為了保證發(fā)酵試驗正常進行，在配料時按干物質(zhì)含量折算成玉米淀粉的量進行投料。結(jié)果表明，試驗組（以玉米淀粉乳作為主要原料）的消后糖含量、溶磷含量及pH值與對照組（以玉米淀粉作為主要原料）相比無明顯差異。

圖2 種子罐中菌株生長情況鏡檢結(jié)果

2.2 消后氨基氮含量

由表1可知，在3株生產(chǎn)用菌株的各次平行試驗中，試驗組的消后氨基氮含量均高于相應的對照組。微生物的生長和產(chǎn)物合成需要氮源，其主要用于菌體細胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成［4］。氨基氮含量高有利于菌絲生長和擴繁時合成自身所需要的蛋白質(zhì)等物質(zhì)［5］，特別是在發(fā)酵種子罐和發(fā)酵罐前期，培養(yǎng)基中氨基氮含量充足會使得菌絲快速生長和大量繁殖，有助于快速提高菌濃，也有利于后期發(fā)酵。

圖3 發(fā)酵罐中菌株生長情況鏡檢結(jié)果

表1 氨基氮含量測定結(jié)果 mg/100 mL

2.3 菌絲生長情況鏡檢

在金霉素發(fā)酵過程中對生產(chǎn)用菌株的生長情況進行鏡檢。種子罐中主要對比指標是菌絲的數(shù)量，發(fā)酵罐中主要對比的指標是菌絲形態(tài)變化特征，即菌體由絲狀轉(zhuǎn)變?yōu)辄c狀的周期長短。由圖2可知，發(fā)酵20 h時，試驗組JHSW-13#菌株的菌絲在數(shù)量上要比對照組JHSW-13#菌株的多，且菌絲分支多，生長速度比對照組快。由圖3可知，發(fā)酵4 h時，試驗組JHSW-13#菌株的菌體已經(jīng)由絲狀轉(zhuǎn)變?yōu)辄c狀，而同周期的對照組菌體還處于絲狀，即試驗組的菌絲形態(tài)變化周期相對于對照組提前，而該周期的提前有利于金霉素的生產(chǎn)。JHSW-28#菌株和JHSW-44#菌株鏡檢結(jié)果與JHSW-13#菌株一致。

表2 不同發(fā)酵階段及周期的菌濃測定結(jié)果 %

表3 不同發(fā)酵周期效價測定結(jié)果 U/mL

2.4 菌濃

在金霉素發(fā)酵過程中，菌濃是移種的主要指標，當種子罐在發(fā)酵24 h的菌濃達到20%~25%時可移種發(fā)酵。移入發(fā)酵罐后，菌體迅速擴繁，菌濃增加，在40 h左右時，菌濃達到50%，此后菌濃基本不再增加，與補料、蒸發(fā)等形成動態(tài)平衡，菌濃保持在45%~55%。結(jié)果表明，試驗組的種子罐和發(fā)酵罐菌濃的提升速度與對照組相比其有明顯優(yōu)勢。由表2可知，試驗組發(fā)酵罐在34 h定時樣的菌濃已經(jīng)高于50%（50.2%），而對照組發(fā)酵罐在40 h定時樣的菌濃才高于50%（50.3%）。種子菌濃的快速提升，不僅有利于縮短種子罐的周期以及發(fā)酵罐菌濃的快速提升，也有利于縮短發(fā)酵周期，提前產(chǎn)生目標產(chǎn)物［6-8］。

2.5 效價

效價是指某一物質(zhì)引起生物反應的功效單位，可用理化方法檢測，也可用生物方法測定［9］。在金霉素生產(chǎn)中，效價是衡量生產(chǎn)工藝水平最直接的指標，效價的高低直接說明產(chǎn)品含量的高低，影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量。由表3可知，試驗組發(fā)酵罐的效價與對照組同周期相比具有明顯優(yōu)勢，該種優(yōu)勢一直持續(xù)到放罐；試驗組放罐效價比對照組高1 672 U/mL，提高了6.85%。

3 討論與展望

該研究結(jié)果表明，在金霉素生產(chǎn)過程中，采用玉米淀粉乳代替玉米淀粉作為主要原料，不僅可以使種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的氨基氮含量提高，而且按比例折算后的玉米淀粉乳不影響培養(yǎng)基中消后糖含量、溶磷含量及pH值；種子罐中菌絲生長速度及菌濃等指標提前達到工藝要求，可以縮短生長周期，提前移種；發(fā)酵罐中菌絲生長速度較快，形態(tài)變化時間提前，使目標產(chǎn)物提前產(chǎn)生，有利于發(fā)酵產(chǎn)物含量的提升；整個發(fā)酵過程中，從起步效價直到放罐效價，采用玉米淀粉乳的優(yōu)勢明顯，且最終效價高于傳統(tǒng)原料。

以玉米淀粉乳生產(chǎn)玉米淀粉成品需要經(jīng)過蛋白質(zhì)分離、脫水、干燥等后期工序，若用玉米淀粉乳為原料可以將各工序消耗的電、蒸汽、壓縮空氣、水、人工等成本及相應的污水全部省去，直接用于金霉素的發(fā)酵，而且在發(fā)酵配料過程中由玉米淀粉乳帶入的水會代替配料時所需要的部分水。對于金霉素的大規(guī)模生產(chǎn)，可以直接鋪設(shè)管道由淀粉公司直接向發(fā)酵公司輸送玉米淀粉乳進入配料罐，經(jīng)配料投入發(fā)酵罐，中間省去的工序、運輸、人工等成本，有助于降低金霉素的生產(chǎn)成本。

在生物工程領(lǐng)域中，常利用玉米淀粉作為主要原料進行發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)，例如黃原膠、土霉素、克拉維酸等［10-11］，因此，可以嘗試利用玉米淀粉乳代替玉米淀粉進行生產(chǎn)，并推廣該項技術(shù)。若能在其他發(fā)酵產(chǎn)品實現(xiàn)該項技術(shù)的應用，對節(jié)能減耗、減少排污、降低成本、提高生產(chǎn)效率具有重要意義。

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