艾偉昌 ，方忠意 ，李金磊 ，董 鵬 ，狄元冉 ，高延玲 ，吳志明 ，王 璐 ，劉振陽

（1．河南省野生動(dòng)物救護(hù)中心，河南 鄭州 450044；2．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008；3．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的常駐菌，一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，尤其易引起嬰兒和幼畜（禽）嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致病性大腸桿菌可分為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、產(chǎn)vero細(xì)胞毒素大腸桿菌（VTEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸侵襲性大腸桿菌 （EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）和尿道致病性大腸桿菌（UPEC）等。

雞大腸桿菌病是由大腸桿菌（E．coli）的某些致病性菌株所引起的多種疾病的總稱，也是對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重的一種細(xì)菌性疾病，臨床癥狀以及典型病理多變化，經(jīng)常同病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)感染，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上主要應(yīng)用喹諾酮類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類藥物對(duì)大腸桿菌病進(jìn)行預(yù)防和治療。近些年由于抗菌藥物的廣泛使用、不合理應(yīng)用，使得肉雞體內(nèi)大腸桿菌耐藥菌株出現(xiàn)與耐藥譜不斷擴(kuò)大［1］，普遍存在的細(xì)菌耐藥性與抗菌藥物的選擇壓力有關(guān)［2］，耐藥菌株的不斷出現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。

該研究對(duì)河南省4個(gè)地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)抽取樣品進(jìn)行大腸桿菌分離、鑒定，隨后進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)。初步掌握了河南省雞源大腸桿菌的耐藥情況，為進(jìn)一步防控雞源大腸桿菌病提供了重要的理論依據(jù)和臨床試驗(yàn)資料，為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶臨床合理用藥提供了參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源：2017年1—11月抽取鄭州、開封、焦作、許昌4個(gè)地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)肛門拭子樣品120批。具體抽樣數(shù)量見表1。

表1 2017年樣品抽樣數(shù)量統(tǒng)計(jì)

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑：一次性無菌采樣棒（BPW），購(gòu)自鄭州君越科萊特健康科技有限公司；麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板購(gòu)自BD公司。

1.1.4 儀器設(shè)備：低溫?fù)u床—數(shù)字SHKE6000-8CE（Thermo Fisher Scientific），細(xì)菌濁度儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)（BD PhoenixTM-100）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)增菌：將一次性無菌采樣棒采集的樣品盡快送到實(shí)驗(yàn)室，（36±1）℃培養(yǎng) 16～20 h， 同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.2.2 樣品的分離純化及鑒定：取預(yù)增菌菌液1～2環(huán)，劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂上，（36±1）℃培養(yǎng)16～20 h，選取單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上經(jīng)鑒定的大腸桿菌，用生理鹽水調(diào)制0.5 MCF，吸取10 μL加入到肉湯中，然后分別取100 μL加入到96孔藥敏板中，（36±1）℃培養(yǎng) 16～20 h，讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

經(jīng)預(yù)增菌、大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基的分離純化，最后經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，河南地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)共分離大腸桿菌100株，總體分離率為83.3%（100/120）。其中鄭州地區(qū)分離率最高，為100%（30/30）；焦作地區(qū)分離率次之，為90.0%（27/30）；開封、許昌地區(qū)分離率相對(duì)較低，分別為 76.7%（23/30）和 66.7%（20/30）。 具體結(jié)果見表2。

表2 2017年河南省雞場(chǎng)大腸桿菌分離情況

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離的100株大腸桿菌，對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異噁唑、恩諾沙星、復(fù)方新諾明的耐藥率較高，分別為 88.0%、87.0%、86.0%、85.0%、81.0%；對(duì)氧氟沙星、強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、氟苯尼考、頭孢噻呋中度耐藥，耐藥率在40.0%～80.0%；對(duì)多黏菌素E、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶、美羅培南較為敏感，耐藥率均在20%以下。具體結(jié)果見圖1、表 3。

2.3 不同地區(qū)耐藥結(jié)果

從不同地區(qū)來看，耐藥結(jié)果存在明顯差異：鄭州地區(qū)雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、恩諾沙星、氧氟沙星耐藥率明顯低于其他3個(gè)地區(qū)，其中對(duì)氧氟沙星耐藥率低于其他3個(gè)地區(qū)45%以上；開封地區(qū)大腸桿菌對(duì)磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考耐藥率明顯低于其他3個(gè)地區(qū)，其中對(duì)磺胺異噁唑的耐藥率低于其他3個(gè)地區(qū)40%以上；焦作地區(qū)大腸桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、大觀霉素、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶的耐藥率明顯高于其他3個(gè)地區(qū)，其中對(duì)大觀霉素的耐藥率高于其他3個(gè)地區(qū)45%以上；許昌地區(qū)大腸桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素、頭孢噻呋的耐藥率明顯低于其他3個(gè)地區(qū)；鄭州、焦作兩地區(qū)大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、多黏菌素E的耐藥率明顯高于開封、許昌地區(qū)。具體結(jié)果見圖1、表3。

2.4 多重耐藥結(jié)果

總體來說，分離的100株雞源大腸桿菌多重耐藥嚴(yán)重，3耐及3耐以上菌株占84.0%，多重耐藥主要集中于3～6耐，占77.0%，其中3耐最多，占28.0%。其中，鄭州地區(qū)3耐及3耐以上菌株占83.3%，3耐最多，占26.7%；開封地區(qū)3耐及3耐以上菌株占78.3%，3耐最多，占30.4%；焦作地區(qū)3耐及 3耐以上菌株占 85.2%，3耐最多，占33.3%；許昌地區(qū)3耐及3耐以上菌株占90.0%，4耐最多，占40.0%；具體結(jié)果見圖2。

3 結(jié)論與討論

養(yǎng)殖戶用藥過程中選藥、劑量、療程不當(dāng)，嚴(yán)重濫用藥物（不少養(yǎng)殖戶在未確定病因的情況下，大量使用不同種類的抗菌藥物）等行為均可導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。大多數(shù)雞場(chǎng)的大腸桿菌存在著廣泛的耐藥性，給藥物治療帶來很大的難度。

圖1 2017年河南省雞源大腸桿菌對(duì)16種抗菌藥物的耐藥情況

表3 2017年河南省規(guī)模雞場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況 %

圖2 2017年河南省雞場(chǎng)大腸桿菌多重耐藥結(jié)果

該試驗(yàn)從河南省4個(gè)地區(qū)抽取樣品120批，共分離雞源大腸桿菌100株，分離率為83.3%。該結(jié)果比孫蓉蓉［3］等從發(fā)病水貂中分離大腸桿菌的分離率［為 35.7%（10/28）］要高，比孫剛?cè)?］等從豬雞糞便中分離大腸桿菌的分離率［為100%（15/15）］要低，表明不同動(dòng)物來源、不同采樣部位及動(dòng)物不同健康程度大腸桿菌的分離率存在差異。

分離菌株對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異噁唑、恩諾沙星、復(fù)方新諾明的耐藥率均超過80%，對(duì)氧氟沙星、強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、氟苯尼考、頭孢噻呋耐藥率在40%～80%，4個(gè)地區(qū)之間耐藥結(jié)果存在差異。該研究中雞源大腸桿菌對(duì)磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、大觀霉素的耐藥率分別為86.0%、81.0%、66.0%和 39.0%，比寧昆等［5］的研究雞源大腸桿菌對(duì)磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、大觀霉素的耐藥率 （分別為100%、91.7%、87.5%和70.8%）要低；而對(duì)恩諾沙星、頭孢噻呋耐藥率（分別為85.0%和54.0%）比其結(jié)果（58.3%和41.7%）要高。比張彬［6］等從腹瀉雞病料中分離的大腸桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素的耐藥率（為91.0%）要低。該研究分離的大腸桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥率為38.0%，比朱二勇［7］等從診斷為子宮內(nèi)膜炎的患牛中分離的大腸桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥率 （為11.8%）要高；而對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率比其研究耐藥率（為95.9%）要低。該試驗(yàn)結(jié)果對(duì)四環(huán)素的耐藥率為88.0%，比蒲承君［8］等研究雞源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率（為100%）要低，表明不同地區(qū)、不同用藥情況以及動(dòng)物健康狀況不同其耐藥結(jié)果也存在差異，該結(jié)果和肖利君［9］的研究結(jié)果一致。大腸桿菌在不同地區(qū)的耐藥性差異較大，在臨床應(yīng)用時(shí)，要因地制宜，切勿亂用藥。

從多重耐藥情況來看，河南省雞源大腸桿菌多重耐藥情況嚴(yán)重，3耐及3耐以上菌株占84.0%，該結(jié)果比植嬋萍［10］等的研究——有機(jī)農(nóng)場(chǎng)雞源大腸桿菌3重耐藥及以上所占比例為56.4%要高；同饒麗麗［11］等的研究屠宰前雞源大腸桿菌9重耐藥比例最高（為19.20%），存在差異，表明不同環(huán)境其用藥情況存在差異，大腸桿菌多重耐藥情況不同。

從該試驗(yàn)結(jié)果來看河南省雞源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象已相當(dāng)嚴(yán)重。在今后的養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)消毒，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，科學(xué)合理地使用抗生素，選用中草藥或生物制劑進(jìn)行治療，必要時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感性藥物進(jìn)行針對(duì)性治療。同時(shí)注意交叉用藥和聯(lián)合用藥，逐步減少雞源大腸桿菌的耐藥性的產(chǎn)生。

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［1］王影，李欣南，韓鐫竹，等．某肉雞場(chǎng)雞源大腸桿菌耐藥性跟蹤檢測(cè)與分析 ［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（12）：3329-3337．

［2］王影，李欣南，韓鐫竹，等．大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生與傳播機(jī)制研究現(xiàn)狀［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016（1）：32-37．

［3］孫蓉蓉，鄒玲，劉文華，等．水貂大腸桿菌的分離鑒定及 藥 敏 試 驗(yàn) ［J］. 安 徽 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ，2015，43 （11）：119，126．

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［5］寧昆，沈莉萍，王曉旭，等．上海市動(dòng)物源性大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2016，33（9）：23-26．

［6］張彬，韓志霞，馬金玉，等．河南省部分地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性研究 ［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（2）：127-131．

［7］朱二勇，殷麗霞，曲立春，等．黑龍江雞西地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌分離鑒定及耐藥性研究［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2014，35（2）：18-19．

［8］蒲承君，呂明環(huán)，曾鈺涵，等．雞、豬糞便源大腸桿菌對(duì)4種抗生素耐藥性的比較 ［J］.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017，12（1）：141-147．

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［10］植嬋萍，郭小婷，姚旭，等．有機(jī)農(nóng)場(chǎng)雞、豬源大腸桿菌耐藥性研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（12）：3351-3357．

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