張槐，彭吾訓(xùn)，劉鋼，張健，張飛，王健波，趙胤，李青

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是骨組織工程研究中首選的種子細(xì)胞，該細(xì)胞易向成骨方向誘導(dǎo)和分化，近年來由于其強(qiáng)增殖力和具有多向分化潛能，在干細(xì)胞研究中引起廣泛關(guān)注［1］。但BMSCs定向分化需要合適的細(xì)胞因子調(diào)控，而且在體內(nèi)移植過程中，細(xì)胞存活率低下［2］。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的基本成員，能促進(jìn)BMSCs遷移、增殖和分化［3］，也是一種強(qiáng)大的毛細(xì)血管增殖刺激劑，能為BMSCs生長(zhǎng)提供充足的血供和營(yíng)養(yǎng),但局部使用時(shí)存在諸多問題，如半衰期短、使用劑量大和價(jià)格昂貴等［4］。目前，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因改造干細(xì)胞已成為干細(xì)胞移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5］。本研究利用慢病毒載體將bFGF基因轉(zhuǎn)染到BMSCs中，探討bFGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響，并獲得持久過表達(dá)bFGF的BMSCs，可能為上述問題的解決提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。4～6周齡清潔級(jí)新西蘭大白兔4只，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量1.0～1.5 kg。（2）主要材料與試劑。3%戊巴比妥鈉（MERCK公司，德國(guó)），Percoll分離液、堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒、嘌呤霉素、CCK-8溶液（北京索萊寶生物科技有限公司），ALP分析試劑盒（BioAssay Systems，美國(guó)），茜素紅染色試劑盒、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物科技有限公司），bFGF基因過表達(dá)慢病毒和慢病毒陰性對(duì)照（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司），bFGF、ACTB（內(nèi)參）引物、cDNA合成試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，Anti-CD44/FITC、兔抗兔Anti-bFGF、兔抗兔Antiβ-actin、山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，在兔股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端穿刺，以預(yù)存肝素的注射器抽取骨髓液1～2 mL，再用PBS制成單細(xì)胞懸液。采用密度梯度離心法分離細(xì)胞后，完全培養(yǎng)基重懸，以細(xì)胞密度為1×105/mL接種3 mL于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁情況，當(dāng)細(xì)胞接近80%～90%融合時(shí)，加入胰酶按1∶3消化傳代。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD44）的表達(dá)；采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，于誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，應(yīng)用ALP染色和茜素紅染色鑒定其成骨分化潛能。

1.2.2 過表達(dá)bFGF基因慢病毒載體構(gòu)建 過表達(dá)bFGF基因慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建，載體中包含嘌呤霉素抗藥基因，見圖1。

1.2.3 載有bFGF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs及篩選 （1）取第3代BMSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，取2 mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞匯合約30%時(shí)，以預(yù)實(shí)驗(yàn)中最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（50）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染條件分為bFGF轉(zhuǎn)染組、空病毒組及未轉(zhuǎn)染組。10 h后更換新鮮培養(yǎng)基，每天鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，轉(zhuǎn)染3 d后于倒置熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)情況。（2）當(dāng)細(xì)胞匯合度約80%～90%時(shí)，將細(xì)胞1∶3傳代。次日加入含嘌呤霉素（2 mg/L）的培養(yǎng)基篩選，每2 d更換1次，待未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部死亡時(shí)，將嘌呤霉素減至1 mg/L，維持篩選。

Fig.1 The lentiviral vector(GV367)and clone site icon圖1 慢病毒載體（GV367）及克隆位點(diǎn)圖譜（MCS為多克隆位點(diǎn)）

1.2.4 RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)bFGF表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性 3 s，60℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，引物序列見表1。依據(jù)檢測(cè)所得各組Ct值結(jié)果，計(jì)算2-ΔΔCt值來表示各組bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平。細(xì)胞裂解提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度一致后，煮沸變性，然后依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。封閉完成后，分別加入目的一抗Anti-bFGF（1∶300稀釋）、內(nèi)參一抗 Anti-β-actin（1∶7 500稀釋），4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶7 500稀釋）室溫孵育1 h，最后進(jìn)行化學(xué)顯影，所得條帶采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析圖像。β-actin作為內(nèi)參蛋白，以bFGF蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 The RT-PCR primer sequences of bFGF/ACTB表1bFGF、ACTB RT-PCR引物序列

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖特性 取bFGF轉(zhuǎn)染組、空病毒組第3代細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，以2×104/mL（100μL/孔）接種于7塊96孔板中，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于每天同一時(shí)間取一板檢測(cè)，檢測(cè)前更換新培養(yǎng)基后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，在450 nm測(cè)定光密度（OD）值，根據(jù)結(jié)果描繪細(xì)胞增殖曲線。

1.2.6 細(xì)胞增殖周期的測(cè)定 取bFGF轉(zhuǎn)染組、空病毒組及未轉(zhuǎn)染組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，取1 mL加入流式管中，離心后加入500μL 70%冷乙醇重懸，4℃過夜。PBS洗滌2次，加入100μL RNase A重懸，37℃溫育30 min，加入400μL PI染液混勻，4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 ALP活性檢測(cè) 取bFGF轉(zhuǎn)染組、空病毒組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，以1 mL/孔接種于24孔板中，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第7、14、28天，應(yīng)用ALP分析試劑盒檢測(cè)各組ALP的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染情況 采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法，獲得大量形態(tài)均一的BMSCs（圖2A），細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng)，形狀呈長(zhǎng)梭形、多角形。細(xì)胞表面抗原CD44陽(yáng)性率達(dá)99%以上（圖3）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，茜素紅、ALP染色均呈陽(yáng)性（圖2B、C）?；蜣D(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)bFGF轉(zhuǎn)染組、空病毒組、未轉(zhuǎn)染組在形態(tài)學(xué)上無明顯差異（圖2D～F）。于轉(zhuǎn)染后第4天，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)率達(dá)90%以上（圖2G、H）。傳代后以2 mg/L嘌呤霉素篩選，篩選第3天出現(xiàn)細(xì)胞克隆，篩選第6天時(shí)未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部死亡，此時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆匯合達(dá)80%～90%，挑取細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2 各組細(xì)胞bFGF基因、蛋白表達(dá)比較 RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，bFGF轉(zhuǎn)染組mRNA表達(dá)明顯高于其他2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），空病毒組與未轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4A。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示bFGF轉(zhuǎn)染組、空病毒組與未轉(zhuǎn)染組均在17 ku處出現(xiàn)特異性條帶（圖5），其中bFGF轉(zhuǎn)染組bFGF表達(dá)較其他2組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4B。

2.3 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的變化情況 bFGF基因轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖曲線明顯變陡，除1 d時(shí)，各組間OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，之后各時(shí)間點(diǎn)bFGF轉(zhuǎn)染組OD值均高于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞增殖周期結(jié)果，bFGF轉(zhuǎn)染組G0/G1期的細(xì)胞比例較其他2組降低，而在S期與G2/M期，bFGF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比例均較其他2組增高，并且bFGF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期指數(shù)（PrI）在3組中最高（均P＜0.05）。各期中，未轉(zhuǎn)染組與空病毒組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖7。

2.4 各組細(xì)胞ALP活性的比較 各組細(xì)胞中ALP活性在第14天時(shí)達(dá)到高峰，隨后下降，其中bFGF轉(zhuǎn)染組ALP活性在各時(shí)間點(diǎn)均高于空病毒組與未轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05），見圖 8。

Fig.2 BMSCs culture and gene transfection圖2 BMSCs的培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染情況

3 討論

本研究采用BMSCs作為靶細(xì)胞，BMSCs是一種多能干細(xì)胞，易在體外分離和培養(yǎng)［6］，并具有成骨分化潛力和較強(qiáng)的增殖能力［7］，在眾多研究中已證實(shí)其在骨形成中起重要作用［8］，因此被認(rèn)為是用于骨組織工程的良好種子細(xì)胞［9］。獲取BMSCs的方法主要包括流式細(xì)胞術(shù)分離法、全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法。王雪等［10］應(yīng)用Percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得大量形態(tài)均一的 BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD44陽(yáng)性率達(dá)99.96%，與本研究一致，證實(shí)采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法獲取高純度的BMSCs是可行的。

Tab.3 Results of BMSCs surface antigen CD44圖3 BMSCs表面抗原CD44檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 Comparison of bFGF mRNA and protein expression levels between three groups(n=3)圖4 3組細(xì)胞的bFGF mRNA、蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

Fig.5 The protein expressions of bFGF in three groups圖5 3組細(xì)胞bFGF蛋白表達(dá)

Fig.6 Changes of cell proliferation after bFGF gene transfection in three groups圖6 bFGF基因轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞增殖能力的變化

Fig.7 Changes of cell proliferation cycles after bFGF gene transfection in three groups圖7 bFGF基因轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞增殖周期的變化

Fig.8 Comparison of ALP activities between three groups圖8 各組細(xì)胞ALP活性比較

bFGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員之一，在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用［11］。Du 等［12］研究表明bFGF有明顯增強(qiáng)BMSCs增殖的能力，具有保持成骨的能力，能刺激血管再生，促進(jìn)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，將bFGF基因成功導(dǎo)入BMSCs，通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)到bFGF轉(zhuǎn)染組mRNA及蛋白表達(dá)量均高于空病毒組、未轉(zhuǎn)染組，證明bFGF基因成功過表達(dá)。崔利德等［14］研究中利用腺病毒載體將bFGF基因?qū)隑MSCs中，目的基因成功表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

本研究應(yīng)用慢病毒載體將bFGF基因轉(zhuǎn)入BMSCs，相對(duì)質(zhì)粒、腺病毒等載體而言，慢病毒具有目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、低細(xì)胞毒性、低免疫原性、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為組織工程基因改造最具潛力的載體之一［15-16］。將含有bFGF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞增殖曲線、細(xì)胞周期及ALP檢測(cè)來觀察其對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上3組比較無明顯差異，表明慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs本身無明顯影響，這與Kraus等［17］的研究一致。在bFGF轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞增殖分裂能力明顯強(qiáng)于空病毒組與未轉(zhuǎn)染組，可能是bFGF促進(jìn)了BMSCs的增殖。目前bFGF促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明確，Zhang等［18］研究認(rèn)為可能與bFGF促進(jìn)pAKT和pGSK3β的升高有關(guān)。ALP能夠直接反映成骨細(xì)胞早期分化的程度，是骨形成的特異性指標(biāo)［19］，因此眾多學(xué)者通過檢測(cè)ALP活性來觀察BMSCs的成骨效應(yīng)［20］。本研究中，bFGF轉(zhuǎn)染組ALP活性明顯增強(qiáng)，表明bFGF促進(jìn)了BMSCs的成骨分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒載體將bFGF基因成功導(dǎo)入BMSCs，目的基因得到表達(dá)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力與成骨分化能力明顯增強(qiáng)，并證實(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs本身無明顯影響。在Zhang等［21］的研究中，成功將bFGF基因?qū)隑MSCs中，并證實(shí)其能促進(jìn)骨折愈合，這表明bFGF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs有望成為一種新的方法應(yīng)用于骨折、骨缺損的治療。本研究?jī)H在體外培養(yǎng)條件下探討了bFGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響，其在體內(nèi)成血管效應(yīng)及對(duì)骨折、骨缺損修復(fù)效果如何，仍需進(jìn)一步探索。

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