付月月，張雙霞，張國梁

肝纖維化是肝硬化發(fā)生的前奏和必經的中間環(huán)節(jié)，是一種嚴重威脅人類健康的常見疾病［1-2］。慢性肝病大多數都有肝纖維化，其中20%～40%最終發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌［3］。迄今為止，肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全明確，因此尋找和探索治療肝纖維化的有效途徑對防治肝硬化和肝癌有重要意義。夏枯草作為一種唇形科的傳統(tǒng)中藥，主要包括總三萜類、黃酮類、多糖類等生物活性成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多種作用［4-7］。研究表明其在治療肝纖維化上有重要意義［8-9］。夏枯草硫酸多糖（Prunella vulgaris sulfated polysaccharide，PVSP）是夏枯草主要的生物活性成分之一，具有調節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤等作用。本研究采用PVSP作用于四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化模型大鼠，觀察PVSP對肝纖維化的干預作用，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PVSP（天津醫(yī)科大學藥學院），CCl4（天津富宇精細化工有限公司），Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）和α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）引物（Genwiz，北京），Col-Ⅰ和 α-SMA、GAPDH抗體（Abcam，美國），免疫組化二抗、天狼猩紅染色試劑盒、山羊血清（Boster，武漢），逆轉錄試劑盒（Takara，日本）。

1.2 實驗動物 5～6周齡雄性SD大鼠，60只，SPF級，體質量180～200 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，標準鼠食喂養(yǎng)。本研究所有實驗動物操作均遵循實驗動物倫理條律，并經天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1 肝纖維化模型的制備及分組給藥 60只SD大鼠，采用抓鬮法取2組大鼠分別為空白對照組（Blank組）和溶劑對照組（Solvent組），每組10只；Blank組不作任何處理，正常喂養(yǎng)；Solvent組腹腔注射1 mL/kg橄欖油溶液，每周2次，共4周；其余大鼠均腹腔注射1 mL/kg 40%CCl4橄欖油溶液，每周2次，共4周。在CCl4造模過程中，共有9只大鼠死亡，采用抓鬮法將造模成功的31只大鼠分成3組：模型組（Model組）、PVSP高劑量組（PVSP-H組：400 mg/kg）和PVSP低劑量組（PVSP-L組：100 mg/kg），每組10只，剩余1只用于肝纖維化模型的再次鑒定。Model組、PVSP-H組和PVSP-L組均繼續(xù)腹腔注射1 mL/kg 40%的CCl4橄欖油溶液，每周2次，PVSP-H組和PVSP-L組每天1次灌胃給藥，Blank組和Solvent組給予等量生理鹽水，共5周。末次灌胃后禁食24 h，5%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，收集腹主動脈血和肝臟組織。

1.3.2 血清丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）的測定 大鼠麻醉后，腹主動脈取血，2 000 r/min離心15 min，收集血清，放于-80℃保存。采用全自動生化分析儀測定血清ALT和AST。

1.3.3 肝組織病理學檢查 取距離肝右葉同一部位肝組織，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。HE及天狼猩紅染色，光學顯微鏡下觀察肝細胞變性、膠原纖維增生程度及組織形態(tài)學變化。

1.3.4 qRT-PCR檢測Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表達 用TRizol法提取肝組織中RNA，取2μg按逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。PCR引物序列：Col-Ⅰ上游5′-ACAGACCAA?CAACCCAAACTC-3′，下游 5′-ACTTATACCCACATAG?GTCTTCAAG-3′，253 bp；α-SMA 上游 5′-AAGTATCC?GATAGAACACG-3′，下游 5′-TAGATAGGCACGTTGTGAG-3′，296 bp；GAPDH 上游 5′-CCATCAACGACCCCTTCATT-3′，GAPDH 下游 5′-GACCAGCTTCCCATTCTCAG-3′，110 bp。反應條件：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)以后進行熔解曲線分析，2－ΔCt法進行計算。實驗重復3次。

1.3.5 免疫組織化學方法檢測Col-Ⅰ和α-SMA表達 石蠟切片70℃50 min，脫蠟，水化，檸檬酸鹽抗原修復15 min，10% 山羊血清封閉 1 h，一抗（Col-Ⅰ 1∶300，α-SMA 1∶200）4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，DAB染色，蘇木精復染，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 6.0彩色圖像分析軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT和AST的變化 Solvent組血清ALT、AST與Blank組相比差異無統(tǒng)計學意義。與Blank組相比，Model組血清ALT和AST明顯升高（P＜0.05）；PVSP-H 和 PVSP-L組血清 ALT及AST均低于Model組（P＜0.05），其中PVSP-H組較PVSP-L 組更低（P＜0.05），見表 1。

Tab.1 Effects of PVSP on serum levels of ALT and AST表1PVSP對大鼠血清ALT、AST的影響 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of PVSP on serum levels of ALT and AST表1PVSP對大鼠血清ALT、AST的影響 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與 Blank 組相比，b與 Solvent組相比，c與 Model組相比，d與 PVSP-H 組相比，P＜0.05；表 2、3 同

組別Blank組Solvent組Model組PVSP-H組PVSP-L組F ALT（U/L）37.97±4.78 40.48±9.56 131.57±17.84ab 56.91±9.27c 65.98±5.24cd 66.617＊＊AST（U/L）135.83±13.62 127.14±11.03 319.07±20.98ab 166.27±25.18c 274.48±25.31cd 93.308＊＊

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學的變化 HE及天狼猩紅染色結果顯示，Blank組和Solvent組肝組織肝小葉與匯管區(qū)結構正常，肝細胞呈條索狀排列，無明顯肝細胞壞死，無間質擴增，纖維主要分布于匯管區(qū)和中央靜脈周圍。Model組大部分肝小葉結構破壞或消失，肝索排列紊亂，可見肝細胞點狀壞死，有少量炎性細胞排列，肝細胞空泡變性散在分布，間質增生明顯，肝匯管區(qū)及肝小葉壞死區(qū)可見大量纖維組織增生，纖維間隔形成明顯，其界板破壞嚴重，分割、包繞肝小葉。與Model組相比，PVSP-H及PVSP-L組肝小葉結構稍紊亂，較少肝細胞脂肪變性、炎性細胞浸潤，纖維組織輕度增生，匯管區(qū)的纖維增生不明顯，PVSP-H及PVSP-L組纖維化程度較Model組明顯減輕，見圖1。

2.3 各組大鼠肝臟組織中Col-Ⅰ和α-SMA mRNA的相對表達量 Solvent組肝組織中Col-Ⅰ、α-SMA mRNA與Blank組比較差異均無統(tǒng)計學意義。與Blank組相比，Model組肝臟組織中Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表達量升高（P＜0.05）。與Model組相比，PVSP-H及PVSP-L組肝臟組織中Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表達量降低（P＜0.05），其中PVSP-H組較PVSP-L組Col-Ⅰ和α-SMA mRNA表達量更低（P＜0.05），見表 2。

Tab.2 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA mRNA in rat hepatic tissues表2 PVSP對大鼠肝臟組織中Col-Ⅰ、α-SMA mRNA表達的影響 （n=10，±s）

Tab.2 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA mRNA in rat hepatic tissues表2 PVSP對大鼠肝臟組織中Col-Ⅰ、α-SMA mRNA表達的影響 （n=10，±s）

組別Blank組Solvent組Model組PVSP-H組PVSP-L組F Col-Ⅰ0.67±0.20 0.63±0.27 1.72±0.14ab 0.82±0.07c 1.07±0.25cd 14.655＊＊α-SMA 0.80±0.22 0.79±0.11 1.78±0.16ab 0.81±0.09c 1.32±0.18cd 23.478＊＊

2.4 大鼠肝臟組織中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達情況 免疫組化結果顯示，Solvent組肝組織中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白與Blank組差異均無統(tǒng)計學意義。Model組肝組織中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達呈強陽性，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Model組相比，PVSP-H及PVSP-L組肝臟組織中Col-Ⅰ和α-SMA蛋白表達量降低（P＜0.05），其中 PVSP-H 組較 PVSP-L組 Col-Ⅰ、α-SMA 蛋白表達量更低（P＜0.05），見圖 2、3，表 3。

Fig 1 Pathological images of rat hepatic tissues(×100)圖1 大鼠肝組織的病理學觀察（×100）

Fig.2 Expression of Col-Ⅰ in rat hepatic tissues(IHC staining,×100)圖2 大鼠肝組織中Col-Ⅰ的表達（免疫組化染色，×100）

Fig.3 Expression of α-SMA in rat hepatic tissues(IHC staining,×100)圖3 大鼠肝組織中α-SMA的表達（免疫組化染色，×100）

Tab.3 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA in rat hepatic tissues表3 PVSP對大鼠肝臟組織中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達的影響 （n=10，±s）

Tab.3 Effects of PVSP on the expressions of Col-Ⅰand α-SMA in rat hepatic tissues表3 PVSP對大鼠肝臟組織中Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達的影響 （n=10，±s）

組別Blank組Solvent組Model組PVSP-H組PVSP-L組F Col-Ⅰ0.32±0.04 0.30±0.05 0.78±0.09ab 0.42±0.08c 0.58±0.02cd 31.718＊＊α-SMA 0.41±0.07 0.42±0.07 0.98±0.10ab 0.51±0.16c 0.66±0.90cd 16.066＊＊

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種原因所導致的肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應，也是各種急慢性肝病共同的病理過程。能夠引起肝臟損傷的因素經長期、反復的作用，會導致肝細胞變性、壞死，進而引起肝細胞再生和肝內結締組織增生，最終導致肝纖維化形成［10］。CCl4導致的大鼠肝纖維化模型是經典的慢性肝損傷模型，其模型的制備具有簡便易行和造模成功率高等特點［11］。

血清ALT和AST是反映肝損傷的主要指標，肝細胞一旦受損，ALT和AST會大量釋放入血［12］。本研究顯示，Model組血清ALT和AST較Blank組顯著升高，且明顯高于PVSP-H組和PVSP-L組；而PVSP-H組較PVSP-L組降低程度更明顯，說明PVSP具有良好的保肝作用，而高劑量的PVSP的作用更明顯。HE和天狼猩紅染色結果顯示，Model組有大量假小葉形成，肝纖維化程度嚴重；PVSP-H組和PVSP-L組與Model組相比肝纖維化程度較輕，分析其原因可能與PVSP減少肝細胞壞死和抑制膠原纖維的沉積有關。

肝纖維化是肝臟受到損傷因素的持續(xù)刺激使得肝臟中膠原蛋白等細胞外基質（ECM）的增生與降解失去平衡，導致肝臟內纖維結締組織異常沉積的病理過程［13］。有研究發(fā)現，肝纖維化時肝臟膠原蛋白的含量明顯升高，以Col-Ⅰ的升高較為明顯［14］，說明Col-Ⅰ是肝纖維化過程中ECM的主要成分，在肝纖維化中發(fā)揮著重要作用。肝星狀細胞（HSC）屬于肝臟間質細胞，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用；當HSC受到損傷刺激時會發(fā)生表型改變，轉化為具有增殖能力的肌成纖維細胞，該細胞可向損傷部位遷移并增殖，同時可表達各種信號蛋白；α-SMA蛋白是HSC的標志性蛋白，當HSC活化時，α-SMA蛋白表達異常增加，該蛋白具有收縮功能，是肝纖維化形成的另一重要因素［15-17］。因此，Col-Ⅰ和α-SMA是反映肝纖維化程度的重要指標［18］。qRT-PCR和免疫組化的結果顯示，Model組Col-Ⅰ和α-SMA的mRNA和蛋白相對表達量較Blank組顯著增加，而PVSP-H組和PVSP-L組的相對表達量明顯低于Model組，其中PVSP-H組較PVSP-L組降低更明顯，由此推測PVSP的抗纖維化作用可能是通過降低Col-Ⅰ和α-SMA的表達，以減少ECM的生成并促進ECM的降解。本研究為將來PVSP應用于臨床治療肝纖維化又邁進了一步，其具體的分子機制還有待更深入的研究。

［1］Zoubek ME，Trautrein C，Strenad P.Reversal of liver fibrosis：from fiction to reality［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2017，31（2）：129-141.doi:10.1016/j.bpg.2017.04.005.

［2］Pellicoro A，Ramachandran P，Iredale IP.Reversibility of liver fibrosis［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2016，5（Suppl1）：S26.doi:10.1016/j.clinre.2015.06.015.

［3］Pinzani M，Romanelli R，Magli S.Progression of fibrosis in chronic liver diseases：time to tally the score［J］.J Hepatol，2001，34（5）：764-767.doi:10.1016/S0168-8278（01）00055-1.

［4］Fang X，Chang RC，Yuen W，et al.Immune modulatory effects of Prunella vulgaris L.on monocyte［J］.Int J Mol Med，2005，16（6）：491-496.doi:10.3892/ijmm.16.6.1109.

［5］Ryu SY，Oak M，Yoon S，et al.Anti-allergic and antiinflammatory triterpenes from the herb of Prunella vulgaris［J］.Planta Med，2000，66（4）：358-360.doi:10.1055/s-2000-8531.

［6］Zhang Y，But BB，Ooi VE，et al.Chemical properties，mode of action，and in vivo anti-herpes activities of a lignin-carbohydrate complex from Prunella vulgaris［J］.Antivir Res，2007，75（3）：242-249.doi:10.1016/j.antiviral.2007.03.010.

［7］Zhang X，Ao Z，Bello A，et al.Characterization of the inhibitory effect of an extract of Prunella vulgaris on Ebola virus glycoprotein（GP）-mediated virus entry and infection［J］.Antivir Res，2016，127（3）：20-31.doi:10.1016/j.antiviral.2016.01.001.

［8］Hu Y，Yu C，Wu F，et al.Antihepatofibrotic effects of aqueous extract of prunella vulgaris on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats［J］.Planta Med，2016，82（1/2）：97-105.doi:10.1055/s-0035-1558112.

［9］章圣鵬，何勇，徐濤，等.夏枯草總三萜調控ERK、TGFβ1/Smad通路對肝纖維化大鼠的保護作用研究［J］.中國藥理學通報，2015，31（2）：261-266.Zhang SP，He Y，Xu T，et al.Regulatory effects total triterpenoid Prunella vulgarisL.on activities of ERK and TGFβ1/Smad signaling pathway in protecting hepatic fibrosis in rats［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2015，31（2）：261-266.

［10］Friedman SL.Hepatic fibrosis-overview［J］.Toxicology，2008，254（3）：120-129.doi:10.1016/j.tox.2008.06.013.

［11］邵佳亮，萬贊艷，胡國信.四氯化碳誘導大鼠肝纖維化改良的研究［J］.南昌大學學報（醫(yī)學版），2011，51（7）：40-51.Shao JL，Wan ZY，Hu GX.Improved rat model of liver fibrosis induced by CCL4［J］.Journal of Nanchang University（Medical Science），2011，51（7）：40-51.

［12］Pinzani M，Barragan J.Update on the pathophysiology of liver fibrosis［J］.Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2010，4（4）：459-472.doi:10.1586/egh.10.47.

［13］Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury［J］.J Biol Chem，2000，275（4）：2247-2250.doi:10.1074/jbc.275.4.2247.

［14］Karsdal MA，MAnon JJ，Genovese F，et al.Novel insights into the function and dynamics of extracellular matrix in liver fibrosis［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2015，308（10）：807-830.doi:10.1152/ajpgi.00447.2014.

［15］Atzori L，Poli G，Perra A.Hepatic stellate cell：a star cell in the liver［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（8/9）：1639-1642.doi:10.1016/j.biocel.2009.03.001.

［16］Novo E，Cannito S，Paternostro C，et al.Cellular and molecular mechanisms in liver fibrogenesis［J］.Arch Biochem Biophys，2014，548（9）：20-37.doi:10.1016/j.abb.2014.02.015.

［17］Ikeda R，Ishii K，Hoshikawa Y，et al.Reactive oxygen species and NADPH oxidase 4 induced by transforming growth factor β1 are the therapeutic targets of polyenylphosphatidylcholine in the suppression of human hepatic stellate cell activation［J］.Inflamm Res，2011，60（6）：597-604.doi:10.1007/s00011-011-0309-6.

［18］He YH，Li Z，Ni MM，et al.Cryptolepine derivative-6h inhibits liver fibrosis in TGF-β1-induced HSC-T6 cells by targeting the Shh pathway［J］.Can J Physiol Pharmacol，2016，94（9）：1-6.doi:10.1139/cjpp-2016-0157.