李洪有，鐘長春，蔡 芳，霍冬敖，張曉娜，陳慶富*

(1 貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心， 貴陽 550001；2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 成都 611130)

鐵是植物正常生長和發(fā)育所必需的微量元素之一，其作為眾多金屬酶的氧化還原輔因子參與了植物呼吸作用、光合作用、花青素和葉綠素合成等多個重要的生理代謝過程[1-2]。鐵缺乏將會影響植物體內(nèi)激素和葉綠素的合成，造成植株矮化和葉片黃化，嚴(yán)重時將會導(dǎo)致作物大量減產(chǎn)、品質(zhì)變劣[3-5]。同樣，鐵元素也是人體必需的營養(yǎng)元素，人體缺鐵將會導(dǎo)致缺鐵性貧血。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球大約有25%的人患有缺鐵性貧血。缺鐵性貧血將會對人體健康造成嚴(yán)重影響，據(jù)統(tǒng)計僅在2010年因缺鐵性貧血早死和失能的人就達(dá)46 000人之多[6]。雖然已有的方法，如通過增加飲食的多樣性和口服含鐵制劑對貧血有著較好的預(yù)防和治療作用，但這些方法需要投入較高的成本，不是經(jīng)濟(jì)可取的。植物是人類主要的食物來源之一，通過基因操作策略開發(fā)富鐵作物品種也許是解決這一問題行之有效的方法。但通過基因操作策略不管是開發(fā)富鐵還是耐鐵缺乏作物品種，其前提都需要很好地理解植物鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配的分子機(jī)制。

通常，植物通過鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將土壤中的二價鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)根中，隨后根中的鐵離子以鐵-檸檬酸復(fù)合體形式由地下部位轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部位，最后分配到各個需要的組織和器官中[3, 7]。在這三個過程中，檸檬酸介導(dǎo)的鐵離子由根向地上部位的轉(zhuǎn)運(yùn)是最為重要的，因?yàn)樗苯記Q定了分配到地上部位各組織和器官中的鐵含量。植物中第一個被克隆到的參與植物鐵由根向地上部位轉(zhuǎn)運(yùn)的基因是擬南芥AtFRD3[8]。AtFRD3編碼蛋白屬于MATE(multidrug and toxin efflux)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明AtFRD3是一個檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9]。AtFRD3突變將會導(dǎo)致突變植物根維管束積累大量的鐵，同時減少地上部分鐵含量，造成植株葉片黃化，通過嫁接實(shí)驗(yàn)和不同生態(tài)型擬南芥群體QTL分析進(jìn)一步證明AtFRD3的功能是將檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)到根木質(zhì)部與鐵離子螯合進(jìn)而促進(jìn)鐵由根向地上部分長距離轉(zhuǎn)運(yùn)[9-12]。在水稻中，Yokosho等[13]克隆了AtFRD3的同源基因OsFRDL1，該基因主要在根中柱鞘細(xì)胞中表達(dá)，其突變會造成突變植株葉片黃化，韌皮部汁液檸檬酸含量和地上部分鐵含量下降，根部鐵含量增加，表明水稻OsFRDL1基因與擬南芥AtFRD3基因具有相同的功能，同時也表明FRD3基因參與鐵由根部向地上部位轉(zhuǎn)運(yùn)的功能在單子葉植物和雙子葉植物中是高度保守的。除模式植物擬南芥和水稻外，大豆中也克隆到了FRD3基因的同源基因GmFRD3a和GmFRD3b，但尚缺乏對二者的功能研究[14]。

甜蕎作為一種糧藥兼用作物，含有豐富的鐵元素，其鐵含量大約是水稻和小麥的2～3倍[15]。 因此，甜蕎不僅是缺鐵性病人的理想食物之一，而且還是利用生物強(qiáng)化策略培育富鐵作物品種的理想材料。目前，有關(guān)蕎麥鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因的克隆未見報道，其鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制尚不清楚。本研究利用同源克隆策略結(jié)合RT-PCR技術(shù)，從甜蕎‘赤甜1號’中分離到FeFRD3基因，對該基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR對甜蕎不同器官和缺鐵、鐵過量處理不同時間下根中FeFRD3的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，以期為今后深入研究其生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為甜蕎‘赤甜1號’，由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心保存；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購自大連寶生物公司。

1.2 方 法

1.2.1植物材料處理挑選飽滿的甜蕎‘赤甜1號’種子，分別用75%乙醇和0.4% NaClO消毒2 min和15 min，用無菌水將種子沖洗干凈，再將種子浸泡在無菌水中暗培養(yǎng)12 h，隨后將種子播種于盛有營養(yǎng)土(草炭∶蛭石=3∶1)的營養(yǎng)缽中，置于人工氣候室培養(yǎng)。待幼苗長至三葉時，取幼苗的根、莖和葉樣，并將剩余的長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移至全營養(yǎng)液(100 μmol/L EDTA-Fe)中水培5 d，隨后將幼苗分為兩組，一組在缺鐵營養(yǎng)液(1 μmol/L EDTA-Fe)中培養(yǎng)，另一組在高鐵營養(yǎng)液(250 μmol/L EDTA-Fe)培養(yǎng)，分別在0、12、24、48、96和144 h取根樣。所有樣品取樣后立即凍于液氮中，并在-80 ℃保存待用。

1.2.2RNA提取及cDNA利用RNA simple Total RNA Kit(天根，北京)試劑盒提取各樣本的總RNA，具體操作參照說明書進(jìn)行；用1.2%的瓊脂糖檢測RNA的質(zhì)量和完整性；用NanoDrop2000檢測總RNA的純度和濃度。利用PrimeScript II1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)合成第一鏈cDNA，具體操作參照說明書進(jìn)行。

1.2.3引物設(shè)計與合成根據(jù)從甜蕎基因組數(shù)據(jù)庫BGBD(Buckwheat Gennome Database, http://buckwheat. kazusa.or.jp/)[16]比對搜索到的推測的FRD3同源基因序列(Fes_sc0002908.1. g000006.aua.1)，利用BioXM 2.6和DNAMAN軟件設(shè)計基因正向引物KF(5′-ATGGATGGTGGAGGTCAGTT-3′)和反向引物KR(5′-GC GTTAATCGTTAAATCTTAGAA-3′)，擴(kuò)增甜蕎FRD3基因的完整開放閱讀框(ORF)；設(shè)計表達(dá)分析正向引物QF(5′-CTTCGCTTCTTGCTGATGGT-3′)和反向引物QR(5′-CCAAGTCCAACAAGTAGAGC-3′)；根據(jù)FeCACS基因序列[17]設(shè)計內(nèi)參基因引物CACSF(5′-AAGACAGTCAGTTTCGTGCCACCTGA-3′)和CACSR(5′-TCCATGCGTGTTCTACCCAACTCCTT-3′)。所有引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2.4目的基因的克隆以反轉(zhuǎn)錄合成的根第一鏈cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。50 μL PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為：5 μL 10×Buffer for KOD-Plus，5 μL dNTPs(2 mmol/L)，2 μL MgSO4(25 mmol/L)，1.5 μL KF(10 μmol/L)，1.5 μL KR(10 μmol/L)，1.5 μL cDNA，1 μL KOD酶，32.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，58 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸1 min 40 s，35個循環(huán)；68 ℃ 延伸10 min，12 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA回收純化試劑盒(天根，北京)回收目的片段。目的片段加堿基A反應(yīng)后與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子進(jìn)菌液PCR檢測后，送5個陽性克隆到上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.2.5目的基因生物信息學(xué)分析利用NCBI中Blast程序進(jìn)行序列同源比對；通過BioXM 2.6軟件分析ORF，計算編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)；利用TMHMM 2.0在線數(shù)據(jù)庫分析蛋白的潛在跨膜區(qū)[17]；利用WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[18]；利用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白序列多序列比對分析；利用ClustalX 1.83 和MEGA 6.0 軟件采用NJ(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)計算值設(shè)1 000次[19]。

1.2.6目的基因的表達(dá)分析以根、莖、葉、種子、缺鐵和高鐵處理不同時間下的根cDNA為模板，以甜蕎FeCACS基因作為內(nèi)參基因，利用基因特異引物QF和QR檢測目的基因在不同組織中以及缺鐵和高鐵處理不同時間下根中的表達(dá)情況，每個樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)體系為：5 μL SYRB Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus，2X，TaKaRa，大連)，0.4 μL QF(10 μmol/L)，0.4 μL QR(10 μmol/L)，1 μL cDNA，3.2 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，62 ℃ 退火30 s，39個循環(huán)，讀取熒光值；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，讀取熒光值，計算溶解曲線。利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 FeFRD3基因克隆及序列分析

以甜蕎幼苗根cDNA為模板，利用基因特異引物KF和KR擴(kuò)增出一條預(yù)期大小約1 500 bp條帶(圖1)，測序結(jié)果顯示該片段大小為1 557 bp。利用BioXM 2.6軟件分析發(fā)現(xiàn)該序列含有一個1 554 bp ORF，編碼517個氨基酸，編碼蛋白分子量為55.83 kD，等電點(diǎn)為8.48(圖2)。利用DNAMAN軟件將該cDNA序列及其編碼蛋白序列同甜蕎基因組數(shù)據(jù)庫中查詢到的FRD3同源基因的cDNA序列和蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，二者的cDNA序列高度相同，只存在3個多態(tài)性核苷酸，同樣二者蛋白序列也高度相同，只存在1個氨基酸酸多態(tài)性(圖2)。因此將其命名為FeFRD3，GenBank注冊號為MG462907。

M. DL2000； 1. PCR擴(kuò)增片段圖1 甜蕎FeFRD3基因的PCR擴(kuò)增M. DL2000; 1 represents the amplification fragment of PCRFig.1 PCR amplification of FeFRD3 in Fagopyrum esculentum

2.2 FeFRD3蛋白序列分析

利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫對FeFRD3蛋白序列進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果表明，F(xiàn)eFRD3蛋白屬于MATE家族蛋白。采用DNAMAN軟件對甜蕎FeFRD3、擬南芥AtFRD3、大豆GmFRD3a、GmFRD3b和水稻OsFRDL1蛋白序列進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果表明，F(xiàn)eFRD3與其余4個蛋白序列間具有較高的相似性，相似性分別為61%、57%、58%和63%(圖3)。用TMHMM 2.0在線數(shù)據(jù)庫對FeFRD3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其存在8個明顯的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，8個跨膜區(qū)分別位于203～225、246～265、285～307、346～368、383～405、425～447、452～474和481～503氨基酸處(圖2)。利用WoLF PSORT在線數(shù)據(jù)庫對FeFRD3進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明FeFRD3蛋白定位于質(zhì)膜(主要)和液泡膜上。

2.3 FeFRD3系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步探索FeFRD3蛋白與其他物種中已報道的具有檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的MATE家族蛋白間的進(jìn)化關(guān)系，選用與鋁毒抵抗相關(guān)的擬南芥AtMATE、甘藍(lán)BoMATE、玉米ZmMATE1、水稻OsFRDL2和與鐵長距離轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的擬南芥AtFRD3、大豆GmFRD3a和GmFRD3b、玉米GRMZM2G163154.01和水稻OsFRDL1共9個MATE家族蛋白，利用MEGA 6.0 軟件采用NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖4所示，10個MATE家族蛋白可以明顯分為與鋁毒抵抗和鐵長距離轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)兩個分支。FeFRD3聚集在具有鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能的MATE蛋白分支中，并與擬南芥的親緣關(guān)系最近，與大豆的親緣關(guān)系次之，與水稻和玉米的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

方框代表單核苷酸或氨基酸多態(tài)性；下劃線部分為跨膜結(jié)構(gòu)域圖2 FeFRD3基因核酸序列及推測的氨基酸序列Frame represents single nucleotide or amino acid polymorphism; underlined represent transmembrane domainFig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of FeFRD3 gene

AtFRD3. 擬南芥; FeFRD3. 甜蕎; GmFRD3a、 GmFRD3b. 大豆; OsFRD3. 水稻圖3 FeFRD3與其他植物FRD3同源蛋白的多序列比對AtFRD3. Arabidopsis thaliana; FeFRD3. Fagopyrum esculentum; GmFRD3a, GmFRD3b. Glycine max; OsFRD3. Oryza sativaFig.3 Multiple sequence alignment of FeFRD3 protein and FRD3 homologous proteins from other species

AtFRD3、 AtMATE. 擬南芥; BoMATE. 甘藍(lán); FeFRD3. 甜蕎; GmFRD3a、 GmFRD3b. 大豆; OsFRD3、 OsFRDL1. 水稻; ZmMATE、 GRMZM2G163154.01. 玉米圖4 FeFRD3蛋白與其他物種MATE家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹AtFRD3, AtMATE. Arabidopsis thaliana; BoMATE. Brassica oleracea; FeFRD3. Fagopyrum esculentum; GmFRD3a, GmFRD3b. Glycine max; OsFRD3, OsFRDL1. Oryza sativa. ZmMATE, GRMZM2G163154.01. Zea maysFig.4 Phylogenic tree of FeFRD3 and other plant MATE family proteins

圖5 FeFRD3基因的組織表達(dá)Fig.5 Tissue expression profiles of FeFRD3 gene

2.4 FeFRD3基因在不同組織中的表達(dá)分析

利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測FeFRD3基因在不同組織部位中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)eFRD3基因在根、莖、葉和種子中均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量不同，其中在根中的表達(dá)量最高，大約是葉中的3倍和莖的5倍，在種子中表達(dá)量最低，幾乎不表達(dá)。

2.5 FeFRD3基因?qū)θ辫F和高鐵脅迫的響應(yīng)

利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析FeFRD3基因在根中的表達(dá)對缺鐵和高鐵脅迫的響應(yīng)，結(jié)果如圖6所示，缺鐵脅迫沒有誘導(dǎo)FeFRD3基因在根中的表達(dá)；而高鐵處理明顯誘導(dǎo)了FeFRD3基因在根中的表達(dá)，其表達(dá)在處理12 h開始受誘導(dǎo)，隨后表達(dá)量逐漸上升，在96 h表達(dá)量達(dá)到最大，大約是0 h的3倍，隨后表達(dá)量開始下降。

-Fe代表缺鐵處理；++Fe代表高鐵處理圖6 FeFRD3基因在缺鐵和高鐵脅迫下的表達(dá)-Fe represent deficiency iron treatment; ++Fe represent high iron treatmentFig.6 Expression levels of FeFRD3 under Fe deficiency and high Fe treatments

3 討 論

鐵元素是植物正常生長和發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，同時也是人體維持正常生理代謝不可或缺的。植物是人類主要的食物來源之一，其中大部分植物以地上部位作為人類的食源。因此，了解植物尤其是作物中鐵由根向地上部位長距離轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制對利用生物強(qiáng)化策略培育富鐵作物品種具有重要指導(dǎo)意義。

本研究從甜蕎‘赤甜1號’中克隆了FeFRD3基因。FeFRD3蛋白屬于MATE家族。目前，植物MATE家族成員中，具有檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白可以分為參與鋁毒抵抗和鐵由根向地上部位轉(zhuǎn)運(yùn)2種。蛋白序列比對分析表明，F(xiàn)eFRD3與擬南芥AtFRD3、大豆GmFRD3a、GmFRD3b和水稻OsFRDL1蛋白序列間有較高的相似性，而與鋁毒抵抗相關(guān)的擬南AtMATE[22]、甘藍(lán)BoMATE[23]、玉米ZmMATE1[24]和水稻OsFRDL2[25]蛋白序列間的相同性相對較低。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，F(xiàn)eFRD3與擬南AtFRD3、大豆GmFRD3a、GmFRD3b和水稻OsFRDL1聚為一支，并且與擬南芥AtFRD3親緣關(guān)系最近。這些結(jié)果表明，克隆到的FeFRD3基因是FRD3同源基因，其可能具有擬南芥AtFRD3和水稻OsFRDL1基因類似的功能。FeFRD3基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高，這與擬南芥AtFRD3和水稻OsFRDL1基因表達(dá)相似[8, 13]，進(jìn)一步暗示FeFRD3基因可能具有擬南芥AtFRD3和水稻OsFRDL1基因類似的功能。FeFRD3的表達(dá)不受缺鐵脅迫誘導(dǎo)，這與水稻OsFRDL1的表達(dá)相同，但與擬南芥AtFRD3和大豆GmFRD3a、GmFRD3b表達(dá)受缺鐵脅迫誘導(dǎo)相反，表明在不同物種中，F(xiàn)RD3基因在缺鐵脅迫中可能具有不同功能[8, 14]。值得注意的是，雖然FeFRD3基因的表達(dá)不受缺鐵脅迫誘導(dǎo)，但其表達(dá)卻明顯受高鐵脅迫誘導(dǎo)，表明其可能在高鐵脅迫下具有將檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)木質(zhì)部與鐵螯合后將根中過多的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部位起著解毒作用。然而，F(xiàn)eFRD3基因是否具有將鐵由根向地上部位轉(zhuǎn)運(yùn)以及參與鐵解毒的功能仍需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 李俊成, 于 慧, 楊素欣, 等. 植物對鐵元素吸收的分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報, 2016,52(6): 835-842.

LI J C, YU H, YANG S X,etal. Research progress of molecular regulation of iron uptake in plants[J].PlantPhysiologyJournal, 2016,52(6): 835-842.

[2] MOMONOI, K, YOSHIDA, K, MANO, S,etal. A vacuolar iron transporter in tulip, TgVit1, is responsible for blue coloration in petal cells through iron accumulation[J].PlantJournal, 2009,59(3): 437-447.

[3] KOBAYASHI T, NISHIZAWA N K. Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants[J].AnnualReviewofPlantBiology, 2012,63(1):131-152.

[4] 丁 偉, 周 蔥, 劉 超, 等. 缺鐵脅迫對梨葉片中GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的影響[J]. 西北植物學(xué)報, 2015,35(2): 233-238.

DING W, ZHOU C, LIU C,etal. Effect of iron-deficiency on the expression of GA signal transduction related genes in leaf of ‘Dangshansuli’ pear (PyrusbretschneideriRehd.)[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinia, 2015,35(2): 233-238.

[5] BRIAT J F, DUBOS C, GAYMARD F. Iron nutrition, biomass production, and plant product quality[J].TrendsinPlantScience, 2015,20(1): 33-40.

[6] MURRAY C J L, LOPEZ A D. Measuring the global burden of disease[J].NewEnglandJournalofMedicine, 2013,369(5): 448-457.

[7] VERBON E H, TRAPET P L, STRINGLIS I A,etal. Iron and Immunity[J].AnnualReviewofPhytopathology, 2017,55(1): 355-375.

[8] ROGERS E E, GUERINOT M L. FRD3, a member of the multidrug and toxin efflux family, controls iron deficiency responses inArabidopsis[J].PlantCell, 2002,14(8): 1 787-1 799.

[9] DURRETT T P, GASSMANN W, ROGERS E E. The FRD3-mediated efflux of citrate into the root vasculature is necessary for efficient iron translocation[J].PlantPhysiology, 2007,144(1): 197-205.

[10] GREEN L S, EE ROGERS E E. FRD3 controls iron localization inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2004,136(1): 2 523-2 531.

[11] ROSCHZTTARDTZ H, SéGUéLA-ARNAUD M, BRIAT J F,etal. The FRD3 citrate effluxer promotes iron nutrition between symplastically disconnected tissues throughoutArabidopsisdevelopment[J].PlantCell, 2011,23(7): 2 725-2 737.

[12] CHRISTOPHE P, STéPHANIE L, CéCILE Letal. Natural variation at the FRD3 MATE transporter locus reveals cross-talk between Fe homeostasis and Zn tolerance inArabidopsisthaliana[J].PlosGenetics, 2012,8(12): e1003120.

[13] YOKOSHO K, YAMAJI N, UENO D,etal. OsFRDL1 is a citrate transporter required for efficient translocation of iron in rice[J].PlantPhysiology, 2009,149(1): 297-305.

[14] ROGERS E E, WU X, STACEY G,etal. Two MATE proteins play a role in iron efficiency in soybean[J].JournalofPlantPhysiology, 2009,166(13): 1 453-1 459.

[15] AHMED A, KHALID N, AHMAD A,etal. Phytochemicals and biofunctional properties of buckwheat: a review[J].JournalofAgriculturalScience, 2014 ,152(3): 349-369.

[16] YASUI Y, HIRAKAWA H, UENO M,etal. Assembly of the draft genome of buckwheat and its applications in identifying agronomically useful genes [J].DNAResearch, 2016,23(3): 215-224.

[17] KROGH A, LARSSON B, VON HEIJNE G,etal. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes [J].JournalMolecularBiology, 2001,305(3): 567-580.

[18] HORTON P, PARK K J, OBAYASHI T,etal. WoLF PSORT: protein localization predictor[J].NucleicAcidsResearch, 2007,35: W585-W587.

[19] KUMAR S, NEI M, DUDLEY J,etal. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J].BriefBioinform, 2008,9(4): 299-306.

[21] YOKOSHO K, YAMAJI N, MA J F.OsFRDL1 expressed in nodes is required for distribution of iron to grains in rice[J].JournalofExperimentalBotany, 2016,67(18): 5 485-5 494.

[22] LIU J, MAGALHAES J V, SHAFF J,etal. Aluminum-activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to conferArabidopsisaluminum tolerance[J].PlantJournal, 2009,57(3): 389-399.

[23] WU X, LI R, SHI J,etal.BrassicaoleraceaMATE encodes a citrate transporter, and enhances aluminum tolerance inArabidopsisthaliana[J].PlantandCellPhysiology, 2014,55(8): 1 426-1 436.

[24] MARONa L G, PINEROS M A, GUIMARAES C T,etal. Two functionally distinct members of the MATE (multidrug and toxic compound extrusion) family of transporters potentially underlie two major Al tolerance QTL in maize[J].PlantJournal, 2010,61(5): 728-740.

[25] YOKOSHO K, YAMAJI N, KASHINO-FUJII M,etal. Functional analysis of a MATE geneOsFRDL2 revealed its involvement in Al-induced secretion of citrate, but less contribution to Al tolerance in rice[J].PlantandCellPhysiology, 2016,57(5): 976-985.