邵貴芳，王 姣，張 水，趙 凱，鄧明華

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，昆明 650201)

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)是發(fā)生在自然界的一種普遍現(xiàn)象，目前已在200多個(gè)物種中廣泛發(fā)現(xiàn)[1]。作為雜交育種的重要手段，雄性不育的產(chǎn)生往往與線粒體有著密不可分的關(guān)系。線粒體作為植物生長過程的重要產(chǎn)能細(xì)胞器，為植物提供90%以上的能量。研究表明，在大多數(shù)植物中，線粒體的功能紊亂，造成植物在花粉發(fā)育高度需要能量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)因能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致不能產(chǎn)生正常的功能性花粉，從而引起植物的雄性不育[2]。

線粒體呼吸鏈包含4個(gè)復(fù)合體：復(fù)合體Ⅰ(NADH脫氫酶)、復(fù)合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)、復(fù)合體Ⅲ(細(xì)胞色素C還原酶)和復(fù)合體Ⅳ(細(xì)胞色素C氧化酶)。F0F1-ATP合酶被稱為復(fù)合體Ⅴ，但其并沒有電子傳遞活性。線粒體經(jīng)過這些復(fù)合體進(jìn)行電子傳遞，從而構(gòu)成電化學(xué)梯度產(chǎn)生能量，供給植物正常生長。呂俊恒[3]在辣椒雄性不育系9704A和同型保持系9704B的葉片和花蕾的不同時(shí)期發(fā)現(xiàn)，能量代謝的相關(guān)基因G6PDH、MDH、ACO和NDPK，在保持系不同組織、兩系花蕾不同時(shí)期均有差異表達(dá)，認(rèn)為這幾個(gè)基因與辣椒植株的生長發(fā)育密切相關(guān)，它們明顯差異的表達(dá)量，可能引起能量代謝紊亂，導(dǎo)致植株雄性不育。線粒體復(fù)合體是電子傳遞過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，SDH4作為編碼線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅱ亞基的重要基因，其功能的是否正常直接影響著復(fù)合體Ⅰ的生物活性。

RNA編輯是線粒體基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表達(dá)的一種重要方式，其現(xiàn)象普遍存在于植物、動(dòng)物、微生物等有機(jī)生物體，以及細(xì)胞核、線粒體、葉綠體等具有自身遺傳編碼系統(tǒng)的細(xì)胞器中。近年來研究表明，高等植物CMS的發(fā)生與RNA編輯有一定的關(guān)系?；蜣D(zhuǎn)錄后通過堿基的插入、缺失或替換，使RNA產(chǎn)物的長度、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而影響基因的表達(dá)模式或創(chuàng)造嵌合基因，導(dǎo)致線粒體的功能紊亂，造成胞質(zhì)雄性不育[4-6]。

本研究通過對(duì)SDH4基因在保持系不同組織及兩系中花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析，以及在兩系中轉(zhuǎn)錄本編輯位點(diǎn)的分析，以期找到SDH4基因在兩系中差異，為進(jìn)一步研究辣椒雄性不育的形成與能量代謝的關(guān)系提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

辣椒雄性不育系9704A及其保持系9704B，種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，取保持系莖、葉、花、果實(shí)、胎座和種子6個(gè)不同組織作為組織表達(dá)材料；取不育系與保持系造孢細(xì)胞增殖期、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期、小孢子單核期和小孢子成熟期4個(gè)不同時(shí)期花蕾，作為研究兩系表達(dá)譜差異的材料。所有材料取樣后立即凍于液氮，置于-80 ℃超低溫冰箱長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1DNA和RNA提取及cDNA合成本實(shí)驗(yàn)通過BioTeKe公司的試劑盒提取DNA,用Trizol試劑對(duì)各個(gè)組織與花蕾不同時(shí)期的RNA進(jìn)行提取，提取后立即用紫外分光光度儀和1%瓊脂糖凝膠電泳雙重檢測(cè)RNA濃度及純度，檢測(cè)合格后使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

1.2.2SDH4基因的克隆根據(jù)辣椒物種中提供的該基因的編碼序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物F1(AAACGACCAGGTACAGCATA)和R1(GTCATCTGACCAAGGAGCAT)，引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。分別以不育系和保持系的DNA和cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用GenScan (http: //genes. mit. edu /GENSCAN.html) 預(yù)測(cè)基因的cDNA 序列，利用DNAMAN，Editseq，seqman等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步編輯、比對(duì)、人工校對(duì)，并推導(dǎo)出氨基酸序列，氨基酸分子量(Mw) 和等電點(diǎn)(pI)利用Compute pI /Mw Tool (http: //us. expasy. org /tools /pi_tool. html) 來預(yù)測(cè)，利用SignalP 4. 1 server(http: //www. cbs. dtu. dk /services /SignalP) 預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列，使用PSort Ⅱ 程序(http: //psort. hgc. jp) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況，蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域通過NCBI (http: //www.ncbi. nlm. nih. gov) 服務(wù)器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) 工具(http://www. ncbi. nlm. nih. gov /BLAST) 進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用SOPMA 程序(http: //npsa-pbil. ibcp. fr)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)由TMHMM Server version 2. 0 程序(http: //www. cbs. dtu. dk /services /TMHMM) 預(yù)測(cè)。利用ClustalX對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并用MEGA7構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 實(shí)時(shí)定量PCR采用TaKaRa公司熒光定量試劑盒，染料為SYBR Green，在Applied Biosystem熒光定量PCR儀上進(jìn)行。以辣椒Actin片段為內(nèi)標(biāo)，所用Actin引物為F2(TGCAGGAATCCACGAGACTAC)和 R2(TACCACCACTGAGCACAATGTT)； cDNA為模板，根據(jù)SDH4基因的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)熒光定量引物F3(TCAGAAAAGAAACGAGAG)和R3(GCACATAAATGAAGGGAT)。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL體系，包含10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ(購于TaKaRa公司)，10 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，2 μL cDNA模板，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ,6 μL ddH2O；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s,循環(huán)40次。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束，利用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.5SDH4的轉(zhuǎn)錄本分析選取兩系葉片為材料，分別提取DNA和RNA進(jìn)行SDH4基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序,然后比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDH4基因的分離

分別以辣椒雄性不育系與保持系的DNA和cDNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行SDH4基因PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明目的片段為450 bp的完全編碼序列，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

2.2 辣椒SDH4基因的生物信息學(xué)分析

RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，編碼區(qū)全長378 bp,編碼125個(gè)氨基酸(圖2)。生物信息學(xué)分析表明SDH4蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為10.163，分子量為 14 532.54 ku，無信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位顯示該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)的概率是21.7%。通過SOPMA程序預(yù)測(cè)SDH4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有72 aa的α-螺旋(57.60%)，12 aa的延伸鏈結(jié)構(gòu)(9.60%)，無β轉(zhuǎn)角，40 aa的無規(guī)則卷曲(32%)。

2.3 SDH4氨基酸序列比對(duì)及其分子進(jìn)化關(guān)系

對(duì)雄性不育系與保持系PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，雄性不育系與保持系中SDH4的氨基酸序列無差異。通過Blast(protein)比對(duì)可知，辣椒SDH4氨基酸序列與多個(gè)物種SDH4氨基酸序列的相似性分別為：煙草(YP-173457.1)99%，葡萄(YP-002608381.1)93%，酸棗(YP-009241655.1)94%，西瓜(YP-003587239.1)92%，番木瓜(YP-002608211.1)95%，黃瓜(YP-004849351.1)86%，茄子(AK77854.1)96%，林煙草(XP-009778651.1)100%等。利用MegAlin計(jì)算辣椒與其他物種的氨基酸序列的相似度，MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明辣椒的SDH4基因與林煙草和煙草的親緣關(guān)系較近(圖3和4)。

2.4 SDH4基因的組織表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果(圖5)表明，SDH4基因在保持系的6個(gè)組織中均有表達(dá)，但不同組織中表達(dá)差異較為明顯。其中，SDH4基因在種子中的表達(dá)量最多，為莖中表達(dá)量的50倍；葉、果皮、胎座的表達(dá)量相差很小，花中的表達(dá)量僅高于莖，葉、果皮、胎座的表達(dá)量分別是花中表達(dá)量的3.8、3.0和2.0倍。

M．DL2000；A. 9704A；B. 9704B圖1 辣椒SDH4基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification result of SDH4 gene in pepper

*代表終止密碼子圖2 辣椒SDH4基因的 CDS序列及其編碼的氨基酸序列* indicates the stop codonFig.2 The coding region sequence and amino acid sequence of SDH4

2.5 SDH4基因在不育系和保持系不同花期的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果(圖6)表明，在小孢子發(fā)育的造孢細(xì)胞增殖期、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期和小孢子成熟期，SDH4基因在不育系和保持系的表達(dá)量差異不大，但在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，SDH4的表達(dá)量明顯高于保持系。對(duì)于不育系，SDH4基因的表達(dá)在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期最低；保持系中，則在造孢細(xì)胞增殖期最低，隨后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在小孢子成熟期突然驟降。不管是不育系還是保持系，SDH4基因的表達(dá)量均在小孢子單核期達(dá)到最高，而在小孢子成熟期表達(dá)量降低。此結(jié)果表明SDH4基因在不育系和保持系中的表達(dá)存在差異，該差異可能與雄性不育的形成有關(guān)。

2.6 SDH4基因轉(zhuǎn)錄本的編輯位點(diǎn)

RNA編輯指DNA轉(zhuǎn)錄RNA后，核苷酸在RNA上的插入、缺失或堿基替換來改變DNA來源模板遺傳信息的普遍現(xiàn)象，對(duì)中心法則進(jìn)行了新的重要補(bǔ)充[7]。在高等植物中,RNA的編輯一般發(fā)生在編碼區(qū)，且一般是C→U。當(dāng)然，也會(huì)通過對(duì)基因組編碼的C殘基進(jìn)行脫氨基來創(chuàng)造終止密碼子[4]。研究表明，RNA編輯與植物的細(xì)胞性雄性不育的發(fā)生有一定的關(guān)系。

圖3 辣椒與其他物種SDH4基因推導(dǎo)的氨基酸比對(duì)Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of SDH4 from pepper and other plants

在辣椒不育系和保持系中，SDH4都有且只有一處編輯位點(diǎn)，在29位點(diǎn)上編輯方式為C→T(圖7中箭頭),位于密碼子的第2位，導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸變?yōu)榱涟彼?，由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?，增?qiáng)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的疏水性能。推測(cè)不育的形成可能與氨基酸的親疏水性有關(guān)。

3 討 論

琥珀酸脫氫酶復(fù)合物(復(fù)合體Ⅱ)是一種存在于線粒體的高度保守的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由SDH1到醌結(jié)合位點(diǎn)[8],通過跨膜螺旋結(jié)構(gòu)將復(fù)合體錨定在線粒體內(nèi)膜上。最新研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，SDH6和SDH7(SDH3和SDH4的缺失序列)有助于將琥珀酸脫氫酶錨定在線粒體內(nèi)膜上[9]。SDH4活性指標(biāo)對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有重要的指導(dǎo)意義[10-11]。在一些作物中，研究者通過酶細(xì)胞化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不育系和保持系的SDH活性存在差異，推測(cè)可能與雄性不育的形成有關(guān)[12-16]。

標(biāo)尺代表遺傳距離；數(shù)值代表從1 000次重復(fù)計(jì)算得到的Bootstrap百分比值圖4 辣椒與其他物種SDH4基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)化樹分析The scale bar represents genetic distance; Number represents the Bootstrap percentage value calculated from 1 000 replicatesFig.4 The evolutionary tree of amino acid sequences of SDH4 from pepper and other plants

圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±SD；*和**分別代表在0.05和0.01水平差異顯著性。圖6同圖5 SDH4基因在9704B不同組織中的表達(dá)The data of each column in mean±SD (n=3);* indicates significance at 0.05 level;* * indicate significance at 0.01 level. The same as Fig.6Fig.5 The expression of SDH4 gene in different organs of the maintainer line 9704B

SDH4亞基形成，屬于琥珀酸泛醌氧化還原酶家族。但在目前，有研究發(fā)現(xiàn)植物復(fù)合體Ⅱ中出現(xiàn)了4個(gè)其他以外的亞基(成為SDH5～SDH8)。SDH4是位于線粒體電子傳遞復(fù)合體Ⅱ的關(guān)鍵酶，關(guān)系著ATP的產(chǎn)生和生物合成過程碳骨架的形成。SDH4編碼跨膜亞基，跨膜亞基含有血紅素和同一個(gè)基因在植物的不同組織中會(huì)根據(jù)自身的特性與功能進(jìn)行時(shí)空的特異性表達(dá)。這也是造成在同一植株不同組織表達(dá)差異的原因。SDH4作為電子傳遞鏈過程的關(guān)鍵酶，與ATP的產(chǎn)生有著一定的聯(lián)系。一般情況下，年幼的、生長旺盛的器官的呼吸速率高于年老的、衰老的器官；生殖器官(花、果、種子)高于營養(yǎng)器官(莖、葉)。在9704B的6個(gè)組織中，SDH4在種子中的表達(dá)量最高，很有可能采取材料的時(shí)候正好是種子形成期，該時(shí)期的種子需要大量能量及淀粉、蛋白等有機(jī)物質(zhì)來用于細(xì)胞增大，促進(jìn)胚、胚乳或子葉的快速生長。實(shí)驗(yàn)材料選取的葉片可能是新鮮的嫩葉。在不育系和保持系的花期的第2時(shí)期(花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期)，保持系中的SDH4基因的表達(dá)量高于不育系，但在小孢子單核期，不育系中SDH4表達(dá)量驟然上升，且表達(dá)量高于保持系。有研究表明，不育系的小孢子在四分體時(shí)期會(huì)出現(xiàn)異常，到單核期初期，小孢子空癟，并開始解體；到中后期，小孢子質(zhì)核及小孢子壁都開始逐漸降解。從小孢子單核期到小孢子成熟期，SDH4基因在不育系中的表達(dá)均高于保持系。我們推測(cè)，不育因子導(dǎo)致的線粒體功能紊亂，在小孢子正常發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，影響了能量的正常供應(yīng)，從而導(dǎo)致了雄性不育的發(fā)生。

1.造孢細(xì)胞增殖期；2.花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期；3.小孢子單核期；4.小孢子成熟期圖6 SDH4基因在9704A和9704B花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)1. Pporogenous celldivision stage; 2. Pollen mother cell (PMC) meiosis stage; 3. Uninucleate microspore stage; 4. Mature pollen stageFig.6 The expression of SDH4 gene during the 4 flower development stages in 9704A and 9704B

圖7 SDH4基因在辣椒不育系和保持系中轉(zhuǎn)錄本的編輯位點(diǎn)Fig.7 Editing sites in transcript of SDH4 gene in pepper sterile and maintainer line

RNA的正常編輯對(duì)線粒體的正常功能發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)線粒體基因發(fā)生不正確或不完全的RNA編輯時(shí)，其產(chǎn)物可能導(dǎo)致線粒體功能的異常而造成雄性不育[17]。SDH4基因在不育系和保持系中的編輯位點(diǎn)無變化，為完全編輯，但編輯頻率是否會(huì)有差異，從而影響ATP合酶的正常功能，還有待進(jìn)一步的研究。

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