楊飛蕓，劉 坤，崔 爽，王瑞剛,3，李國(guó)婧,3*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018；3 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛存在于植物中的一類天然產(chǎn)物，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果及耐鹽、抗旱、防菌、防病等方面起著重要作用[1]，其生物活性多樣，具有重要的藥用價(jià)值[2]，一直以來(lái)都受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。黃酮類物質(zhì)合成于苯丙烷次生代謝途徑，合成前體是苯丙氨酸和丙二酰輔酶A，經(jīng)PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、IFS等酶催化，經(jīng)過(guò)羥基化、甲氧基化和烷基化過(guò)程形成不同的黃酮類物質(zhì)[3]。同時(shí)這些酶能夠在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)黃酮類物質(zhì)的生物合成進(jìn)行調(diào)控[4-7]。

查爾酮合成酶(CHS)是植物黃酮代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，已有研究表明其對(duì)植物的花和種子等器官的著色及黃酮類物質(zhì)的合成等會(huì)產(chǎn)生重要影響[8]。CHS不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，同時(shí)在植物抵御紫外輻射、病原菌入侵等防御反應(yīng)中也起著重要作用[9]。因此，CHS一直以來(lái)都是黃酮類化合物生物合成調(diào)控代謝工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1983年，Kreuzaler等[10]通過(guò)UV誘導(dǎo)歐芹(Petroselinumhortense)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)出了CHS基因；Reimold等[11]首次克隆到了歐芹的CHS基因全長(zhǎng)并分析了其表達(dá)的氨基酸序列。之后，科學(xué)家陸續(xù)從多種植物中克隆得到CHS基因并進(jìn)行了功能分析。1993年，Li等[12]報(bào)道擬南芥(Arabidopsisthaliana)的CHS突變體對(duì)紫外輻射異常敏感。2009年，Li等[13]的研究闡明了CHS以香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物生成查爾酮的定量反應(yīng)機(jī)制。Jigyasa等[14]證明內(nèi)源性組織特異性短干擾RNA沉默了大豆(Glycinemax)種皮中的CHS基因家族從而導(dǎo)致其色素缺失而呈現(xiàn)黃色種皮。2015年，Chen等[15]發(fā)現(xiàn)在煙草(NicotianatabacumL.)中過(guò)表達(dá)紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)EaCHS1基因可以使轉(zhuǎn)基因植物的黃酮類物質(zhì)含量增加。2017年，Chen等[16]克隆到了煙草的5個(gè)CHS基因并對(duì)其進(jìn)行了功能分析。

中間錦雞兒(Caraganaintermedia)是豆科錦雞兒屬植物，具有良好的飼用、防風(fēng)固沙和藥用功效[17]，抵御逆境能力強(qiáng)[18]，含有多種次生代謝產(chǎn)物，其中黃酮類化合物含量豐富。為了分析其抵抗生物和非生物脅迫能力的機(jī)制，本研究利用其他豆科植物已知的查爾酮合成酶基因(CHS)保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增得到中間錦雞兒查爾酮合成酶基因的保守片段，經(jīng)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到基因全長(zhǎng)[19]，并且構(gòu)建了中間錦雞兒CiCHS基因過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，研究CiCHS基因的功能，為其進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)，同時(shí)為提高作物對(duì)UV輻射等脅迫的抵抗力及耐受性提供有效的基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料

中間錦雞兒種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)和林縣。野生型擬南芥Columbia-0生態(tài)型(Col-0)由內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。擬南芥突變體tt4(SALK_020583C)由東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所高翔老師惠贈(zèng)。

1.2 方 法

1.2.1pCanG-CiCHS植物表達(dá)載體構(gòu)建將CiCHS基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[19]，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生物公司)回收目的片段，插入克隆載體pEASY-Blunt Simple中(北京全式金生物公司)，將測(cè)序驗(yàn)證后的序列通過(guò)SpeI和XbaI(Thermo公司)酶切后連入由CaMV35S驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pCanG-HA中，進(jìn)行菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR鑒定挑取陽(yáng)性克隆。PCR引物合成及產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物公司完成。

1.2.2擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及純合體篩選采用浸花法將重組表達(dá)載體pCanG-CiCHS轉(zhuǎn)入野生型擬南芥[20]，并用25 mg/L卡那霉素篩選陽(yáng)性植株。提取T3代轉(zhuǎn)基因植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CiCHS在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。按照SYBR Premix ExTaq試劑盒(TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)操作，利用Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，稀釋的cDNA模板5 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，DEPC水3.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。所用引物為CiCHS-qF(5′-CGCAGACTATTCTCCCCGATTC-3′)和CiCHS-qR(5′-CCTCCACCAAACTCTTCTCAATGT-3′)，內(nèi)參引物為At EF1α- F(5′-AGAAGGGTGCCAAATGATGAG-3′)和At EF1α-R(5′-GGAGGGAGAGAGAAAGTCACAGA-3′)，基因表達(dá)量以2-ΔCt法計(jì)算，選取3株表達(dá)水平較高的株系進(jìn)行后續(xù)表型實(shí)驗(yàn)。

1.2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥AtCHS表達(dá)量的檢測(cè)提取T3代轉(zhuǎn)基因植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)擬南芥的AtCHS(At5g13930)在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法同轉(zhuǎn)基因純合體CiCHS表達(dá)量的檢測(cè)。所用引物為AtCHS-qF(5′-GGTGCCATAGACGGACATT-3′)和AtCHS-qR(5′-TCCATACTCGCTCAACACG-3′)，內(nèi)參引物為At EF1α- F和At EF1α-R，基因表達(dá)量以2-ΔCt法計(jì)算。

1.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量檢測(cè)采用硝酸鋁比色法進(jìn)行總黃酮的測(cè)定[21]。剪取正常生長(zhǎng)條件下(22 ℃，16 h光照/8 h黑暗)4周大的擬南芥主薹，用液氮研磨成粉末?？傸S酮的提取條件：70%甲醇為溶劑；料液比1∶20；超聲條件溫度60 ℃，功率160 W，70 min；超聲處理后浸泡24 h。浸提液0.8 mL，加5% Na2NO2溶液0.08 mL，攪勻后靜置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.08 mL，攪勻后靜置6 min；加4% NaOH溶液0.8 mL、ddH2O 0.24 mL，攪勻后靜置15 min。8 000 r/min離心10 min，取上清液，使用分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光值，用70%甲醇調(diào)零。

1.2.5轉(zhuǎn)基因擬南芥柚皮苷含量檢測(cè)樣品前處理同總黃酮檢測(cè)的前處理方法。使用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行柚皮苷含量的檢測(cè)(島津LC-20AT高效液相色譜儀)。色譜條件為：色譜柱Unitary C18( 4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水(A)-甲醇(B)(60∶40，V/V)；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm；進(jìn)樣體積10 μL。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自貴州迪大試劑公司。

1.2.6轉(zhuǎn)基因擬南芥丙二醛含量檢測(cè)對(duì)正常條件下生長(zhǎng)4周大的不同基因型擬南芥在距離310 Lux的紫外燈下25 cm處照射1 h后，放回溫室中恢復(fù)24 h。剪取正常生長(zhǎng)和處理后的擬南芥植株主薹，用液氮研磨成粉末。丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7DPPH法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥體外抗氧化活性剪取正常條件下生長(zhǎng)4周大的擬南芥植株主薹，用液氮研磨成粉末。按料液比1∶20加入95%乙醇∶0.1%鹽酸(3∶2，V/V)的混合溶液。超聲提取時(shí)間30 min，溫度60 ℃，功率160 W。超聲處理后浸提24 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。DPPH(1,1-二苯基-2-硝基苦肼)檢測(cè)步驟根據(jù)Thaiponga等[22]的方法進(jìn)行改良。

分別吸?。孩贅悠诽崛∫汉虳PPH溶液(0.1 mmol/L)；②樣品提取液和甲醇；③甲醇和DPPH溶液(0.1 mmol/L)各0.75 mL于2 mL Eppendorf管中，搖勻后在避光條件下反應(yīng)90 min。實(shí)驗(yàn)中將甲醇設(shè)為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)517 nm處分別測(cè)定樣品吸光度Ai(樣品與DPPH溶液反應(yīng)后測(cè)得的吸光值)、Aj(樣品與甲醇反應(yīng)后測(cè)得的吸光值)和A0(甲醇與DPPH溶液反應(yīng)后測(cè)得的吸光值)。

根據(jù)下列公式計(jì)算擬南芥植株提取液對(duì)DPPH的清除率：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.8擬南芥突變體tt4的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)采用浸花法將重組表達(dá)載體pCanG-CiCHS轉(zhuǎn)入擬南芥tt4突變體，并將收取的種子種在含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性植株。提取T3代轉(zhuǎn)基因植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異性引物CiCHS-F和CiCHS-R對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定。同時(shí)對(duì)所收種子的種皮顏色進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCanG-CiCHS植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因純合體植株鑒定

利用PCR擴(kuò)增到長(zhǎng)度為1 173 bp的CiCHS編碼區(qū)(圖1，A)，連接到pEASY-Blunt Simple克隆載體中，測(cè)序正確后用SpeI和XbaI雙酶切連接到pCanG-HA表達(dá)載體。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pCanG-CiCHS轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖1，B)，提取驗(yàn)證正確的菌落質(zhì)粒用SpeI和XbaI雙酶切鑒定，能夠切出目的片段，表明載體構(gòu)建成功(圖1，C)，構(gòu)建好的載體圖譜見(jiàn)圖1，D。

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將重組植物表達(dá)載體pCanG-CiCHS轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，篩選出具有卡那霉素抗性的陽(yáng)性純合體株系6株，提取這些株系的RNA并合成cDNA，利用特異性引物CiCHS-F和CiCHS-R進(jìn)行RT-PCR鑒定。結(jié)果如圖2，A所示，以野生型擬南芥cDNA作陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，以中間錦雞兒cDNA作陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增到和轉(zhuǎn)基因株系相同的條帶，在6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均擴(kuò)增出目的條帶，表明CiCHS在各轉(zhuǎn)基因株系中均有表達(dá)。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CiCHS在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平(圖2，B)，選取表達(dá)量較高的3個(gè)株系OE-14、OE-15和OE-20進(jìn)行后續(xù)表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

M. DL2000；A. CiCHS的ORF；B. pCanG-CiCHS的菌落PCR鑒定：1～10. 隨機(jī)挑取的單菌落；C. pCanG-CiCHS的酶切驗(yàn)證：1. 空載體對(duì)照;2. pCanG-CiCHS被Spe Ⅰ和XbaⅠ雙酶切鑒定；D. 表達(dá)載體圖圖1 pCanG-CiCHS表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定M. DL2000; A. The ORF of CiCHS; B. Identification of pCanG-CiCHS by PCR: 1-10. Random single colony; C. Identification of pCanG-CiCHS digested by restriction enzyme: 1. Vector control; 2. Digestion product by Spe Ⅰ and XbaⅠ; D. Schematic representation of the expression vector pCanG-CiCHSFig.1 The construction and identification of pCanG-CiCHS recombinant vector

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥AtCHS表達(dá)量的變化

前人研究表明，異源CHS基因轉(zhuǎn)化植物時(shí)可能引起內(nèi)源CHS基因表達(dá)量降低或不表達(dá)。本研究提取CiCHS表達(dá)量較高的3個(gè)株系OE-14、OE-15和OE-20的RNA并合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AtCHS在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平(圖3)。圖3顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中AtCHS的表達(dá)量均降低到野生型的十分之一左右，說(shuō)明CiCHS在擬南芥中的表達(dá)抑制了擬南芥自身AtCHS的表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量的變化

按照硝酸鋁比色法的具體步驟繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4，A)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，蘆丁質(zhì)量濃度x和吸光值y的關(guān)系為：y= 12.244 4x-0.014 4，(R2= 0.998 8)，表明在蘆丁濃度為0～0.07 mg/mL范圍內(nèi)該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。按此方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量的測(cè)定，利用測(cè)得的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果(圖4，B)表明轉(zhuǎn)基因各株系總黃酮的含量均高于野生型，且達(dá)到極顯著水平。結(jié)合2.2的結(jié)果可以得出，過(guò)表達(dá)CiCHS可以使得擬南芥中總黃酮含量明顯增加。

A. CiCHS過(guò)表達(dá)株系的PCR鑒定：M. DL2000；Col-0. 陰性對(duì)照(野生型擬南芥cDNA)；Ci. 陽(yáng)性對(duì)照(中間錦雞兒cDNA)；OE-14、OE-15、OE-20、OE-23、OE-29和OE-31. CiCHS過(guò)表達(dá)株系；B. CiCHS過(guò)表達(dá)株系的qRT-PCR檢測(cè)圖2 CiCHS過(guò)表達(dá)株系鑒定及表達(dá)水平檢測(cè)A. RT-PCR identification of CiCHS transgenic Arabidopsis lines：M. DL2000; Col-0. Negative control (wild type Arabidopsis thaliana cDNA); Ci. Positive control (Caragana intermedia cDNA); OE-14, OE-15, OE-20, OE-23, OE-29 and OE-31. Transgenic Arabidopsis lines; B. Quantitative real-time PCR analysis of CiCHS expression in CiCHS transgenic linesFig.2 Identification and expression analysis of CiCHS in transgenic Arabidopsis

圖3 轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tCHS表達(dá)水平檢測(cè)Fig.3 Expression analysis of AtCHS in transgenic Arabidopsis

2.4 HPLC法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥柚皮苷含量

按照1.2.4樣品的前處理要求制備樣品溶液，按1.2.5的色譜條件對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的柚皮苷含量進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)樣及樣品的色譜結(jié)果見(jiàn)圖5。

由標(biāo)樣和樣品的色譜圖可以看出，在此色譜條件下分離的柚皮苷峰形尖銳，無(wú)拖尾。按此條件繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1.475 5×10-5，(R2=0.999 2)，表明在柚皮苷濃度為0～200 μg/mL的范圍內(nèi)該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。利用峰面積法計(jì)算不同株系擬南芥柚皮苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由計(jì)算結(jié)果可知，轉(zhuǎn)基因擬南芥各株系柚皮苷含量均高于野生型，說(shuō)明CiCHS基因異源表達(dá)后增加了擬南芥中柚皮苷的含量。

A. 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線；B. 擬南芥各株系總黃酮含量；**表示差異極顯著(P<0.01)，下同圖4 野生型和轉(zhuǎn)CiCHS基因擬南芥總黃酮含量比較A. The standard curve of rutin; B. The content of total flavonoids in different Arabidopsis lines; ** indicates significant difference among samples at 0.01 level, the same as belowFig.4 The content of total flavonoids in different Arabidopsis lines

A. 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；B. 擬南芥各株系色譜圖：WT. 黑色線；OE-14. 粉色線；OE-15. 藍(lán)色線；OE-20. 紅色線圖5 擬南芥各株系柚皮苷色譜結(jié)果A. Standard sample; B. The naringin chromatogram map of different Arabidopsis lines: WT. Black line; OE-14. Pink line; OE-15. Blue line; OE-20. Red lineFig.5 The naringin chromatogram result of different Arabidopsis lines

2.5 紫外照射處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥MDA含量的影響

前人研究顯示紫外等非生物脅迫處理會(huì)增加植物中黃酮類等次生代謝產(chǎn)物的積累，從而降低由非生物脅迫引起的植物損傷。本研究對(duì)未經(jīng)紫外照射處理和經(jīng)紫外照射處理的樣品進(jìn)行MDA含量檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，未經(jīng)紫外照射的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中MDA含量差異極明顯，經(jīng)紫外照射處理后野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中MDA含量均增加，但轉(zhuǎn)基因株系的含量均低于野生型，并且轉(zhuǎn)基因株系與野生型的差異極顯著。說(shuō)明過(guò)表達(dá)CiCHS減少了正常生長(zhǎng)過(guò)程中和紫外脅迫處理后擬南芥體內(nèi)MDA的生成量，從而降低其膜脂過(guò)氧化程度，保護(hù)植物免受傷害。

表1 轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥柚皮苷含量

圖6 紫外處理下擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因株系MDA含量變化Fig.6 The content of MDA in different Arabidopsis lines

2.6 DPPH法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥體外抗氧化活性

根據(jù)1.2.7的步驟繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7，A)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，吸光值y和DPPH濃度x的關(guān)系為：y=7.908 3x+0.000 2，(R2=0.999 9)，表明在DPPH濃度為0～0.10 mmol/L的范圍內(nèi)該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。按此方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥DPPH自由基的清除率實(shí)驗(yàn)，利用測(cè)得的吸光值，根據(jù)前述方程計(jì)算DPPH自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖7，B。3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系DPPH自由基清除能力明顯高于野生型。說(shuō)明CiCHS基因異源表達(dá)后顯著增加了擬南芥清除DPPH自由基的能力，且清除能力與基因表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量關(guān)系。

2.7 CiCHS基因部分恢復(fù)擬南芥突變體tt4的表型

擬南芥tt4突變體由于AtCHS的缺失而導(dǎo)致種皮無(wú)色[23]。本研究將CiCHS基因轉(zhuǎn)入tt4突變體，收取轉(zhuǎn)基因植物T3代種子與tt4和WT進(jìn)行對(duì)比(圖8)，發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)后轉(zhuǎn)基因植物的種皮呈現(xiàn)淺棕色，部分恢復(fù)了tt4缺失的表型，說(shuō)明CiCHS基因在擬南芥中可以參與黃酮代謝，進(jìn)行花青素類物質(zhì)的合成，從而賦予擬南芥種皮顏色。

圖8 CiCHS基因互補(bǔ)tt4突變體的表型Fig.8 Complementary results of tt4 mutant

A.DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線；B. 不同株系DPPH自由基清除率圖7 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥DPPH自由基的清除率A. The standard curve of DPPH; B. The scavenging rate of DPPH radical of different Arabidopsis linesFig.7 The scavenging rate of DPPH radical of different Arabidopsis lines

3 討 論

查爾酮合成酶作為植物類黃酮代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因，對(duì)植物黃酮類化合物的生成量起決定作用。黃酮類化合物是廣泛存在于高等植物中的次生代謝產(chǎn)物，與植物的多種代謝活動(dòng)密切相關(guān)。植物黃酮類花色素的形成受黃酮代謝途徑的控制，決定植物花色和種皮色澤。植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)含量增加可使植物耐受UV損傷能力、抗病能力等顯著提高[9]。

由于基因的共抑制效應(yīng)，異源CHS基因轉(zhuǎn)化植物時(shí)可能引起內(nèi)源CHS基因表達(dá)量降低或不表達(dá)，外源CHS基因表達(dá)量也會(huì)受影響。如Van等的研究結(jié)果顯示，將DFR和CHS基因轉(zhuǎn)入矮牽牛(Petuniahybrida)后，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的花色不會(huì)發(fā)生明顯變化，部分轉(zhuǎn)基因植株的色素積累量還會(huì)降低，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中DFR和CHS基因的表達(dá)量明顯降低[24]。之后，陸續(xù)有人報(bào)道了不同植物中轉(zhuǎn)CHS基因引起的共抑制效應(yīng)。本研究檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因擬南芥中AtCHS基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)株系中AtCHS基因的表達(dá)量大概為野生型的十分之一，說(shuō)明在擬南芥中過(guò)表達(dá)CiCHS抑制了內(nèi)源AtCHS基因的表達(dá)。但由于CiCHS基因的大量表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)過(guò)表達(dá)株系的總黃酮含量均顯著高于野生型，其柚皮苷含量較野生型也有所增加。

研究表明，CHS可以受不同的脅迫處理誘導(dǎo)，如紫外處理、損傷、微生物侵染等，從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)含量的增加，使其抗氧化能力提高[9]。Kim等[25]報(bào)道紫外光刺激了大豆中黃酮醇的積累，與黃酮醇合酶的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。Jaakola等[26]報(bào)道了光照刺激可以促進(jìn)CHS等黃酮生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因，同時(shí)也誘導(dǎo)花青素、黃酮醇等化合物含量的提高。丙二醛是植物細(xì)胞膜受氧化損傷后的重要產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)丙二醛的含量可以判斷細(xì)胞膜的受損程度[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)過(guò)表達(dá)株系的丙二醛含量在紫外處理前后均低于野生型，說(shuō)明CiCHS基因異源表達(dá)后，使擬南芥的丙二醛生成量減少，膜脂過(guò)氧化程度降低。黃酮類化合物具有多酚結(jié)構(gòu)，因此具有很強(qiáng)的清除自由基和抑制由自由基引起的氧化損傷能力。植物清除自由基能力的提高，有利于增加其對(duì)自然界的脅迫抗性，如降低因紫外輻射對(duì)植物造成的傷害等[28]。本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)過(guò)表達(dá)株系清除DPPH自由基的能力均顯著高于野生型。

目前，已經(jīng)在擬南芥中鑒定出22個(gè)透明種皮基因(transparent testa, tt)位點(diǎn)，若這些基因不表達(dá)，其種皮中類黃酮色素的合成與積累將受阻，種子顯示為胚的顏色，呈現(xiàn)典型的黃籽性狀。擬南芥CHS基因突變被鑒定為導(dǎo)致透明種皮的tt4位點(diǎn)。原花青素作為擬南芥種皮色素的主要物質(zhì)在種皮色澤形成中起關(guān)鍵作用，抑制種皮中CHS基因的表達(dá)就阻礙了種皮色素的合成途徑，使擬南芥的種皮無(wú)色，表現(xiàn)為黃籽性狀[23]。Sun等[29]在研究中用小蒼蘭(Freesiahybrida)的FhCHS1互補(bǔ)了擬南芥的tt4突變體，基本補(bǔ)回了種皮的顏色。本研究將CiCHS基因轉(zhuǎn)入擬南芥tt4突變體，觀察轉(zhuǎn)基因植物T3代的種皮顏色，發(fā)現(xiàn)其種皮呈現(xiàn)淺棕色，說(shuō)明CiCHS在突變體中可以表達(dá)，并有相應(yīng)的原花青素類物質(zhì)生成。但互補(bǔ)株系種皮顏色較野生型的棕色明顯不同，可能CiCHS只是部分補(bǔ)充了AtCHS的功能，或者生成了其他種類的黃酮類物質(zhì)而導(dǎo)致原花青素生成量降低，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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