劉德華 王建 高志強 鄒連生 徐鷹

[摘要] 目的 探討脊髓Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號通路在切口痛大鼠中的作用機制。 方法 選取20周齡的SD健康成年雄性SPF級大鼠100只，建立大鼠切口痛模型，于術前和術后0.5 h、1 h、2 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d，采用電子von Frey壓力測痛儀檢測大鼠非術側(cè)和術側(cè)的機械縮足反應閾值（MWT）；于術前和術后2 h、8 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）法檢測脊髓TLR4、NF-κB、白介素1β、（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達水平。 結(jié)果 術后，大鼠術側(cè)的MWT較術前降低，術后2 h時最低，之后逐漸升高，且顯著低于非術側(cè)（P < 0.05）。術后，大鼠脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達水平較術前升高，且術后2 h、8 h、1 d、2 d和3 d與術前比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），術后5 d和7 d與術前比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），術后1 d脊髓TLR4、NF-κB表達水平達到最高，術后8 h脊髓IL-1β、TNF-α表達水平達到最高。采用Pearson相關性分析結(jié)果顯示，大鼠術側(cè)MWT與TLR4和NF-κB表達水平呈負相關（r = -0.473，P < 0.05；r = -0.398，P < 0.05），大鼠脊髓TLR4與IL-1β和TNF-α表達水平呈正相關（r = 0.302，P < 0.05；r = 0.538，P < 0.05）；大鼠脊髓NF-κB與IL-1β和TNF-α表達水平呈正相關（r = 0.283，P < 0.05；r = 0.467，P < 0.05）。 結(jié)論 切口痛大鼠脊髓TLR4/NF-κB信號通路被激活，TLR4、NF-κB表達水平升高，并上調(diào)下游炎性因子IL-1β、TNF-α的表達水平，參與切口痛的調(diào)控過程。

[關鍵詞] Toll樣受體4；核因子κB；切口痛；大鼠

[中圖分類號] R619.6R [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（a）-0023-04

Experimental study of TLR4/NF-κB signal pathway in the mechanism of incisional pain

LIU Dehua1 WANG Jian2 GAO Zhiqiang1 ZOU Liansheng1 XU Ying3

1.Deaprtment of Neurosurgery， First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China； 2.Department of Pathology， Ganzhou People′s Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China； 3.Scientific Research Center， Gannan Medical University， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Toll like receptor 4 （TLR4）/ nuclear factor κB （NF-κB） signal pathway in rats with incisional pain. Methods One hundred healthy adult male Sprague-Dawley （SD） SPF rats of 20 weeks old were selected to establish incision pain models. Before operation and after operation for 0.5 h， 1 h， 2 h， 8 h， 12 h， 1 d， 2 d， 3 d， 5 d， 7 d， the mechanism withdraw threshold （MWT） in non-operative side and operative side of rats were detected by electronic von Frey pressure pain threshold detector. Before operation and after operation for 2 h， 8 h， 1 d， 2 d， 3 d， 5 d and 7 d， the expression of TLR4， NF-κB， interleukin 1β （IL-1β） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in the spinal cord were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （real-time PCR）. Results After operation， the MWT in the operative side of rats was lower than that before operation， which was the lowest after operation for 2 h， then increased gradually， and they were significantly lower than those of non-operative side （P < 0.05）. After operation， the expression levels of TLR4， NF-κB， IL-1β and TNF-α in spinal cord of rats were increased compared with those before operation， which of postoperative 2 h， 8 h， 1 d， 2 d and 3 d had statistically significant differences compared with those before operation （P < 0.05）， which of postoperative 5 d and 7 d had no statistically significant differences compared with those before operation （P > 0.05）. The expression levels of TLR4 and NF-κB in the spinal cord reached the highest after operation for 1 d， and the expression levels of IL-1β and TNF-α reached the highest after operation for 8 h. Pearson correlation analysis showed that there was a negative correlation of MWT in operative side with the expression of TLR4 and NF-κB （r = -0.473， P < 0.05， r = -0.398； P < 0.05）， the TLR4 levels in spinal cord of rats were positively correlated with the expression levels of IL-1β and TNF-α （r = 0.302， P < 0.05； r = 0.538， P < 0.05）， and the NF-κB levels in spinal cord of rats were positively correlated with the expression levels of IL-1β and TNF-α （r = 0.283， P < 0.05； r = 0.467， P < 0.05）. Conclusion The signal pathway of TLR4/NF-κB in spinal cord of rats with incisional pain is activated， the expression levels of TLR4 and NF-κB are increased， and the expression levels of downstream inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α are up-regulated， which is involved in the regulation process of incisional pain.

[Key words] Toll like receptor 4； Nuclear factor κB； Incisional pain； Rat

術后疼痛指術后即刻發(fā)生的急性疼痛，嚴重影響患者的術后治療及恢復[1]。免疫應答和炎性反應參與術后疼痛的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。Toll樣受體4（TLR4）屬于Toll樣受體家族，介導后天免疫和天然免疫[4]。核因子κB（NF-κB）是一種具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控機體炎性反應、免疫應答等多種生理過程[5]。白細胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）作為重要的促炎細胞因子，能夠誘發(fā)炎性反應[6-7]。本研究選取大鼠切口痛模型，探討脊髓TLR4/NF-κB信號通路在切口痛大鼠中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取20周齡的Sprague-Dawley（SD）健康成年雄性SPF級大鼠100只，體重200～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[合格證號：SCXK（京）2007-0001號]。實驗前8 h禁食，自由飲水，室溫（21±2）℃，濕度30%～70%，光照每晝夜12 h。實驗全程嚴格按照國家有關實驗動物的規(guī)定執(zhí)行，經(jīng)生物醫(yī)學研究倫理委員中心批準。

1.2 實驗方法

制備大鼠切口痛模型。大鼠吸入2%異氟醚麻醉，仰臥位固定，左后爪無菌消毒，在足底近端約0.5 cm處向趾部做長約1 cm的縱行手術切口，用鑷子挑起足底肌肉并做縱向切割，保持肌肉完整的起止和附著點，按壓止血，用5-0尼龍線縫合皮膚，手術切口處給予碘伏消毒并覆蓋抗生素軟膏，模型制備完成。大鼠切口痛模型制備成功表現(xiàn)為術后大鼠舔咬術側(cè)后足，術側(cè)后足不愿著地，且無運動障礙等現(xiàn)象。

1.3 觀察指標

1.3.1 測定機械縮足反應閾值（MWT） 隨機選取10只大鼠分別于術前0 h和術后0.5 h、1 h、2 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d，采用電子von Frey壓力測痛儀（美國IITC公司）檢測大鼠非術側(cè)、術側(cè)的MWT。在安靜狀態(tài)下，以持續(xù)增壓的方式觸壓大鼠第3、4趾間的皮膚，當大鼠激現(xiàn)快速甩足、迅速縮回等反應時，停止加壓，讀取測痛儀壓力數(shù)值，即為MWT，測量3次，取平均值。

1.3.2 脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達水平 分別于術前和術后2 h、8 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d各取10只大鼠，處死后取脊髓組織L4～L6段，采用Trizol（美國Invitrogen公司）抽提RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達水平。TLR4引物：5′-GCCTTTTCCAA？鄄AGCTGAGTC-3′，5′-TGACACCATTGAAGCTGAGG-3′，長度200 bp；NF-κB引物：5′-CAAGATCTGCCGA？鄄GTAAACC-3′，5′-TCGGAACACAATGGCCACTT-3′，長度180 bp；IL-1β引物：5′-CCGACCTCATTTTCTTC？鄄TGG-3′，5′-ATGCCATGCGAGTGACTTAG-3′，長度250 bp；TNF-α引物：5′-TGATCCGAGATGTGGAACTG-3′，5′-TTGGGAACTTCTCCTCCTTG-3′，長度180 bp；內(nèi)參GAPTH引物：5′-TCAAGGCTGAGAATGGGAA？鄄G-3′，5′-CGGAGATGATGACCCTTTTG-3′，長度190 bp；PCR反應條件為：94℃預變性2 min；94℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循環(huán)；72℃延伸10 min。采用2-△△Ct法[8]計算目的基因的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 非術側(cè)和術側(cè)切口痛大鼠各時點MWT比較

術前，切口痛大鼠非術側(cè)和術側(cè)MWT比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。非術側(cè)MWT手術前后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。術后，術側(cè)MWT均較術前顯著降低，術后2 h時最低，之后逐漸升高，且顯著低于非術側(cè)，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 各時間點切口痛大鼠脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的相對表達水平比較

術后，切口痛大鼠脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達水平較術前升高，且術后2 h、8 h、1 d、2 d和3 d與術前比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），術后5 d和7 d與術前比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），術后1 d脊髓TLR4、NF-κB表達水平達到最高，術后8 h脊髓IL-1β、TNF-α表達水平達到最高。見表2。

2.3 切口痛大鼠MWT與脊髓TLR4和NF-κB表達水平的相關性

采用Pearson相關性分析結(jié)果顯示，大鼠術側(cè)MWT與TLR4和NF-κB表達水平呈負相關（r = -0.473，P < 0.05；r = -0.398，P < 0.05）。

2.4 切口痛大鼠脊髓TLR4和NF-κB與IL-1β和TNF-α表達水平的相關性

采用Pearson相關性分析結(jié)果顯示，大鼠脊髓TLR4與IL-1β和TNF-α表達水平呈正相關（r = 0.302，P < 0.05；r = 0.538，P < 0.05）；大鼠脊髓NF-κB與IL-1β和TNF-α表達水平呈正相關（r = 0.283，P < 0.05；r = 0.467，P < 0.05）。

3 討論

術后疼痛是機體受到手術刺激后的一系列反應，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[9]。因此，術后疼痛的治療手段是目前研究的熱點。術后創(chuàng)傷組織和炎性細胞釋放炎性介質(zhì)，如IL-1、TNF-α等，導致炎性反應，進而引起疼痛[10-11]。IL-1、IL-6、TNF-α等炎性介質(zhì)能夠誘導初級傳入神經(jīng)分泌iNOS、COX-2等疼痛介質(zhì)，傳入中樞，導致中樞敏化，出現(xiàn)自發(fā)性疼痛、疼痛延時等癥狀[12]。

研究指出大鼠切口痛模型在術后0.5 h術側(cè)后爪表現(xiàn)明顯的痛覺過敏，2 h達到峰值，且可持續(xù)到術后4～7 d[13]。由于大鼠切口痛模型的行為學反應和臨床術后疼痛相似，因此，其在許多研究中已經(jīng)被廣泛使用。本研究結(jié)果顯示，術側(cè)的MWT較術前降低，術后2 h時最低，之后逐漸升高，且低于非術側(cè)。說明本研究建立大鼠切口痛模型成功，該模型具有重復性和穩(wěn)定性。

TLR4主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細胞，膠質(zhì)細胞在術后疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。在切口損傷等刺激作用下，中樞免疫細胞被激活，分泌大量和疼痛相關的因子，如IL-1、TNF-α等，形成炎癥級聯(lián)反應，參與脊髓水平的信號傳導，引起痛覺過敏[15]。當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，在損傷神經(jīng)處NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路及其下游介質(zhì)被激活，引起炎性反應，進而參與疼痛的發(fā)生和發(fā)展[16-18]。本研究結(jié)果顯示，術后，大鼠脊髓TLR4、NF-κB的表達水平升高，并且術后1 d脊髓TLR4、NF-κB表達水平達到最高。結(jié)合大鼠術側(cè)MWT的變化趨勢，Pearson相關性分析結(jié)果顯示，大鼠術側(cè)MWT與TLR4和NF-κB表達水平呈負相關性。說明大鼠切口痛可以激活TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路的上游因子TLR4和NF-κB。

為了驗證整個TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路是否激活，本研究檢測TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路下游炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的表達水平。IL-1β一方面能夠引起疼痛調(diào)制因子（緩激肽、NO等）的升高，另一方面能夠引起神經(jīng)生長因子的升高，誘發(fā)痛覺過敏[19-21]。TNF-α一方面能夠直接作用于中樞感受器，造成中樞過敏，另一方面能夠誘導合成前列腺素E2，釋放兒茶酚、緩激肽，誘導痛覺過敏[22-24]。本研究結(jié)果顯示，術后，大鼠脊髓IL-1β、TNF-α的表達水平升高，并且術后8 h脊髓IL-1β、TNF-α表達水平達到最高。說明大鼠切口痛模型中TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路下游信號因子IL-1β、TNF-α也被激活。且IL-1β、TNF-α表達水平達到最高的時間均早于TLR4、 NF-κB。Pearson相關性分析結(jié)果顯示，大鼠脊髓TLR4與IL-1β和TNF-α表達水平呈正相關；大鼠脊髓NF-κB與IL-1β和TNF-α表達水平呈正相關。提示IL-1β、TNF-α表達水平升高一方面是TLR4/NF-κB信號通路激活，另一方面可能存在其他通路的激活。

綜上所述，切口痛大鼠脊髓TLR4/NF-κB信號通路被激活，TLR4、NF-κB表達水平升高，進而上調(diào)下游炎性因子IL-1β、TNF-α的表達水平，誘發(fā)炎性反應，參與切口痛的調(diào)控過程。

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（收稿日期：2017-10-22 本文編輯：張瑜杰）