王媛媛++曹建++鄧莉

[摘要]目的 探討TOLL樣受體3（TLR3）在大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的表達及作用機制。方法 制備TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠，采用球囊結(jié)扎冠脈方法制作心肌缺血/再灌注動物模型，將60只大鼠隨機分為假手術(shù)組（野生型）（n=15）、缺血/再灌注組（野生型）（n=15）、假手術(shù)組（TLR3-/-）（n=15）、缺血/再灌注組（TLR3-/-）（n=15）。檢測各組大鼠的心肌組織MDA、GSH、CK-MB、LVESV、LVEDV、LVEF及TLR3、NF-κB表達。結(jié)果 缺血/再灌注組（TLR3-/-）的MDA[（9.72±6.15）nmol/L]、CK-MB含量[（1075.76±3.27）U/L]低于缺血/再灌注組（野生型）[（14.85±5.2）nmol/L，（1842.16±4.28）U/L]，GSH含量[（152.46±2.82）mg/L]高于缺血/再灌注組（野生型）[（128.72±1.82）mg/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。缺血/再灌注組（TLR3-/-）組的LVEDV[（602.0±2.7）μl]、LVESV[（516.0±2.9）μl]低于缺血/再灌注組（野生型）[（702.0±4.5）、（516.0±2.9）μl]，LVEF[（42.0±2.8）%]高于缺血/再灌注組（野生型）[（36.0±4.2）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。缺血/再灌注組（野生型）TLR3（0.862±0.158）、NF-κB（0.786±1.784）蛋白表達均高于假手術(shù)組（野生型）（0.315±1.834，0.206±1.924），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。缺血/再灌注組（TLR3-/-）的TLR3蛋白（0.076±1.52）及NF-κB表達（0.625±2.824）低于缺血/再灌注組（野生型），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 TOLL3受體基因缺失在心肌缺血損傷中具有心臟保護作用，其保護機制與減輕NF-κB，減輕心肌缺血/再灌注炎癥反應有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]TOLL樣受體3；心肌缺血/再灌注；核因子-κB

[中圖分類號] R392.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）11（a）-0004-04

Mechanism of Toll-like receptors 3 on heart ischemia/reperfusion injury in rats

WANG Yuan-yuan1 CAO Jian2▲ DENG Li3

1.Department of Cardiology，the third hospital of Nanchang，Jiangxi Province，Nanchang 330009，China；2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Jiangxi Province，Nanchang 330006，China；3.Science and Education Section，the third hospital of Nanchang，Jiangxi Province，Nanchang 330009，China

[Abstract]Objective To investigate the expression of Toll-like receptors 3 and the correlation mechanism of ischemia/reperfusion injury in rats.Methods TOLL-like receptor 3 deficient （TLR3-/-） and wild type （WT） rats were subjected to ischemia/reperfusion induced by ligation of the left anterior descending coronary artery.Sixty rats were divided into 4 groups：sham-operated group （WT） （n=15），myocardial ischemia/reperfusion group （WT） （n=15），sham-operated group （TLR3-/-） （n=15） and myocardial ischemia/reperfusion group （TLR3-/-） （n=15）.The MDA，GSH，CK-MB，LVEDV，LVESV，LVEF and the expression of TLR3，NF-κB in four groups were detecte.Results The level of MDA [（9.72±6.15）nmol/L]，CK-MB [（1075.76±3.27）U/L] in myocardial ischemia/reperfusion group （TLR3-/-） were lower than the myocardial ischemia/reperfusion group （WT） [（14.85±5.2）nmol/L，（1842.16±4.28）U/L]，the value of GSH in myocardial ischemia/reperfusion group （TLR3-/-） was higher than the myocardial ischemia/reperfusion group （WT），and the differences were statistically significant （P<0.05）.The LVEDV [（602.0±2.7）μl]，LVESV [（516.0±2.9）μl] of the myocardial ischemia/reperfusion group （TLR3-/-） were lower than the myocardial ischemia/reperfusion group （WT） [（702.0±4.5）μl，（516.0±2.9）μl]，the LVEF [（42.0±2.8）%] of the myocardial ischemia/reperfusion group （TLR3-/-） was higher than the myocardial ischemia/reperfusion group （WT） [（36.0±4.2）%]，and the differences were statistically significant （P<0.05）.The expression of TLR3 （0.862±0.158），NF-κB （0.786±1.784） of the myocardial ischemia/reperfusion group （WT） were higher than the sham-operated group （WT） （0.315±1.834，0.206±1.924），and the differences were statistically significant （P<0.05）.The expression of TLR3 （0.076±1.52）、NF-κB （0.625±2.824） of the myocardial ischemia/reperfusion group （TLR3-/-） were lower than the myocardial ischemia/reperfusion group （WT），and the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion The TLR3 deficient is important to reduce myocardial I/R injury，it is related to suppress the inflammatory response by down-regulation of NF-κB signaling pathway.endprint

[Key words]Toll-like receptors 3；Myocardial ischemia/reperfusion；NF-κB

世界衛(wèi)生組織報道2008年全世界死于冠心病的人數(shù)占全部死亡人數(shù)的12.8%。心肌缺血/再灌注治療在在恢復心肌供血及供氧的同時，同時會出現(xiàn)心肌超微結(jié)構(gòu)、功能及代謝的損傷，甚至會引起明顯炎癥反應，出現(xiàn)缺血/再灌注損傷，早期對缺血/再灌注損傷進行干預治療，是提高預后的關(guān)鍵[1-3]。Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）是生物體重要的病原體模式識別信號分子，其介導的炎癥反應在缺血/再灌注過程中發(fā)揮重要作用，目前TLR3在心肌缺血/再灌注損傷中的作用機制尚未闡明，本實驗通過制備TLR3基因敲除大鼠，并制備缺血/再灌注模型，來觀察TLR3基因敲除后對大鼠的心肌保護作用及可能作用機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 TLR3基因敲除大鼠[許可證號SCXM（贛）2014-0012]30只，8周齡，雌雄各半，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供。野生型SD大鼠30只，由南昌大學實驗動物中心提供。本研究已經(jīng)通過南昌大學醫(yī)學院動物倫理委員會審查。

1.1.2試劑 肌酸激酶同工酶（CK-MB）監(jiān)測試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA），兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Sigma公司，小鼠抗Akt單克隆抗體、TLR3抗體、NF-κB抗體購自美國Santa Cruz公司，蛋白濃度測定標準品購自普利萊公司。

1.2方法

實驗動物分為4組，分別為假手術(shù)組（野生型）（n=15）、缺血/再灌注組（野生型）（n=15）、假手術(shù)組（TLR3-/-）（n=15）及缺血/再灌注組（TLR3-/-）（n=15）。制作大鼠缺血/再灌注模型，實驗前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉（3.5 ml/kg）大鼠，仰臥位固定，氣管插管，接人工呼吸機（呼吸頻率：70 次/min，潮氣量：20 ml，呼吸時比1∶1）。開胸結(jié)扎冠脈左前降支，胸骨左側(cè)2 mm切開皮膚，鈍性分離肌肉見肋骨，在三四肋間，用拉鉤拉開胸壁，小心剪開心包膜，在左心耳下緣3～4 mm進針，進針深約1.5 mm，斜向右上方肺動脈圓錐方向進針，針距約3～4 mm。穩(wěn)定1 min后，收緊結(jié)扎線，30 min后輕拉松結(jié)線，擴開血管再灌注，縫合[4]。假手術(shù)組僅分離前室間支，不結(jié)扎[4]。假手術(shù)組（野生型）絲線穿過冠狀動脈但左室支但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；缺血/再灌注組（野生型）制作大鼠缺血/再灌注模型；假手術(shù)組（TLR3-/-）絲線穿過冠狀動脈但左室支但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；缺血/再灌注組（TLR3-/-）選取TLR3基因敲除大鼠制作大鼠缺血/再灌注模型。

1.3指標觀測

1.3.1生化指標的檢測 各試驗組大鼠缺血/再灌注2 h后，從腹主動脈采血5 ml，靜置30 min，離心10 min（4℃，3000 r/min），進行血清分離，按照試劑盒說明測定MDA、GSH、CK-MB含量。

1.3.2大鼠左心室收縮期末期容積、舒張末期容積、射血分數(shù)的測定 實驗大鼠經(jīng)過冠脈套扎術(shù)后8周，通過超聲心動圖測左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室射血分數(shù)（LVEF）。選取異氟烷進行輕度全麻，使用12 MHz探頭，從胸骨旁長軸短軸和四個腔室定位獲得二維心室圖，通過Modified Simpson Rule測量LVESV及LVEDV，LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，同一觀察對象采用雙盲法測量所有測量值，所有測量結(jié)果連續(xù)測5次取平均值。

1.3.3 Western blot法檢測TLR3、NF-κB蛋白表達 制模結(jié)束后處死手術(shù)處理后的存活大鼠，按試劑盒說明書步驟提取總蛋白，碾磨心肌組織，BCA法蛋白進行蛋白定量，SDS-PAGE分離樣品后轉(zhuǎn)膜，常溫下TBST封閉過夜，加入一抗后室溫下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗2 h，顯影，定影，掃描。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1四組大鼠MDA、GSH 、CK-MB水平的比較

缺血/再灌注組（TLR3-/-）的MDA、CK-MB含量低于缺血/再灌注組（野生型），GSH含量高于缺血/再灌注組（野生型），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2四組大鼠LVESV、LVEDV、LVEF的比較

缺血/再灌注組（TLR3-/-）組的LVEDV、LVESV低于缺血/再灌注組（野生型），LVEF高于缺血/再灌注組（野生型），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3四組大鼠心肌組織TLR3、NF-κB蛋白表達的比較

缺血/再灌注組（野生型）TLR3、NF-κB蛋白表達均高于假手術(shù)組（野生型），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。缺血/再灌注組（TLR3-/-）的TLR3蛋白及NF-κB表達低于缺血/再灌注組（野生型），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表3）。

3討論

心肌缺血/再灌注損傷常發(fā)生于急性心肌梗塞溶栓術(shù)、體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)及冠脈內(nèi)球囊擴張血管成形術(shù)等過程中。其機理復雜，目前認為與再灌注后氧自由基大量生成、細胞內(nèi)鈣超載、微血管內(nèi)皮細胞損傷及血管內(nèi)皮細胞與血小板聚集粘附有關(guān)。改善缺血區(qū)心肌細胞正常功能，是目前心肌缺血/再灌注研究的重要方面[5-7]。endprint

Toll樣受體家族蛋白分為細胞外區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)，內(nèi)區(qū)與白細胞介素-1受體結(jié)構(gòu)相似的信號傳導結(jié)構(gòu)域組成，能識別侵入體內(nèi)異物，不僅激活固有免疫應答，還可以激活適應性免疫應答，啟動下游的信號通路，通過募集中性粒細胞、吞噬細胞誘導炎癥反應，釋放大量的炎癥因子（如各種白介素因子）介導炎癥的產(chǎn)生[8-12]。人類TLR3由904個氨基酸組成，其相對分子量約為125 KU，可以識別病毒來源的雙鏈RNA，激活NF-κB及干擾素調(diào)節(jié)因子，引起炎性細胞因子的釋放。近年有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3在人動脈粥樣硬化組織起源的平滑肌細胞上的表達上調(diào)，可引起許多趨化因子和炎性細胞因子表達增加，這些因子均具有促動脈粥樣硬化作用。

本實驗通過TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠制作缺血/再灌注模型。缺血/再灌注組（TLR3-/-）反映氧化損傷的MDA含量低于缺血/再灌注組（野生型），反映心肌細胞缺血受損的CK-MB含量降低，GSH含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。缺血/再灌注組（TLR3-/-）的LVEDV、LVESV低于缺血/再灌注組（野生型），LVEF高于缺血/再灌注組（野生型），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示TLR3基因敲除后，可以延緩心室重構(gòu)，改善心功能。實驗結(jié)果提示缺血/再灌注可以刺激TLR3表達，進一步激活NF-κB，引起心肌炎癥反應，加重缺血/再灌注損傷，而在TLR3基因敲除組大鼠，可以通過減少TLR3蛋白及NF-κB表達減輕炎癥反應，對缺血/再灌注心肌起到保護作用。同時有研究發(fā)現(xiàn)TLR3可誘導血管活性氧產(chǎn)生增加，可引起血管舒張功能受損、再內(nèi)皮化減少加劇，內(nèi)皮細胞功能受損[13-15]。

綜上所述，TLR3在心肌缺血/再灌注的發(fā)展過程中起著保護作用，但其確切的機制尚未完全明確，需要進一步明確，為治療心肌缺血/再灌注損傷提供新的治療靶點。

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（收稿日期：2017-08-30 本文編輯：孟慶卿）endprint