郭 均,黃燕燕,劉冬梅,*,孫麗娜,馮立科,楊愛(ài)君,彭小霞,吳 暉,李 理

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司,廣東廣州 510640)

隨著人們生活水平的提高,心血管疾病患病率和死亡率正逐年上升,成為當(dāng)前導(dǎo)致人類死亡的最主要原因之一,占全球總死亡人數(shù)的29%[1]。流行病學(xué)和臨床研究表明,血清中的膽固醇被認(rèn)為是誘發(fā)冠心病動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素,血清膽固醇含量每增加l%,患冠心病等心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)就提高約3%,相反,血清膽固醇水平下降l%,患冠心病的幾率就可減少2%～3%[2]。高膽固醇血癥的特征是血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的增加,其中一個(gè)最快的治療方法是控制血清中膽固醇和甘油三酯[3-4]。臨床上治療高膽固醇血癥的方法主要包括膳食干預(yù)和藥物治療,但他汀類、煙酸類及衍生物、貝特類、膽酸螯合劑等臨床常用藥物都存在使血清轉(zhuǎn)氨酶升高、造成肝毒性等不良反應(yīng),需長(zhǎng)期服用藥物,費(fèi)用較高,病情易反復(fù)。因此,尋找能夠調(diào)節(jié)血清膽固醇含量,緩解并治療高膽固醇血癥的生物制劑具有十分廣闊的應(yīng)用前景。越來(lái)越多的人們采用降膽固醇益生菌制劑來(lái)降低高膽固醇血癥和冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。研究表明,膽鹽水解酶(BSH)活性被認(rèn)為是降低膽固醇的關(guān)鍵因素[5-6]。

L.plantarumDMDL 9010是本課題組從陳年泡菜中分離而得,其降低體內(nèi)血清膽固醇的能力是未知的。因此,本研究采用體外篩選所得的優(yōu)良菌株(L.plantarumDMDL9010)應(yīng)用于高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠體內(nèi),采用邊造模邊灌胃乳酸菌菌懸液的方法來(lái)研究高劑量(109CFU/mL)[18]和低劑量(107CFU/mL)乳酸菌菌懸液對(duì)大鼠血脂水平、肝臟大體形態(tài)及病理切片、肝臟和糞便脂質(zhì)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumDMDL 9010[17]課題組從陳年泡菜中分離得到的[17],保藏號(hào)CGMCC 5172,于2011年其首次被鑒定為戊糖乳桿菌DMDL 9010,其16S rDNA基因庫(kù)登錄序列號(hào)為KJ 917253。

雄性SD(Sprague Dawley)大鼠 8周齡，SPF級(jí)，50只,體重160～200 g,南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào)SYXK(粵)2012-0081,合格證編號(hào)440021000;基礎(chǔ)飼料 蛋白質(zhì)20%,脂肪4.2%,碳水化合物50%,中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;高脂飼料 豬油10%,膽固醇1%,膽鹽0.2%,基礎(chǔ)飼料88.8%,混勻造粒,在飼喂大鼠之前進(jìn)行輻照殺菌。

海藻糖 廣州卯林試劑有限公司;福爾馬林、無(wú)水乙醇、二甲苯、鹽酸 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;抗壞血酸 廣州齊云生物技術(shù)有限公司;甘油三脂TG、總膽固醇TC、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C試劑盒 中生北控生物技術(shù)股份有限公司;總膽汁酸TBA試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司;其他試劑 分析純。

YXQ-LS-18SI立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅公司;氮吹儀EFGC-11155 Organo-mation Associates,Inc;全自動(dòng)生化分析儀HITACHI 7180 Hitachi high-Tech Science Systems Co.,Ltd。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種凍干粉制備L.plantarumDMDL9010菌株于37 ℃、pH6.8的條件下在盛有MRS肉湯培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中生長(zhǎng)18 h。通過(guò)8000 r/min(4 ℃)離心15 min后倒去上清液收集菌泥,在無(wú)菌操作條件下,按海藻糖(10%,m/V)與菌泥的體積比為1.5∶1的比例加入,于-40 ℃條件下預(yù)凍5 h,使其均勻凍結(jié)在容器內(nèi)壁上,進(jìn)行真空冷凍干燥18～20 h 后,復(fù)水測(cè)定其活菌數(shù)為9.30×109CFU/g。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分組 50只SPF級(jí)雄性SD大鼠自由攝食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后按照體質(zhì)量分為5組,飼料喂養(yǎng)及灌胃按照表1所示。大鼠飼喂70 d,每天上午9點(diǎn)灌胃,保證充足的食物和飲水。每7 d對(duì)50只大鼠稱質(zhì)量并收集大鼠糞便樣品,計(jì)算食物消耗量,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥容積。取1.2.1 所制備的L.plantarumDMDL 9010凍干粉按照1∶1 (g/mL)溶解于經(jīng)滅菌處理后的生理鹽水中制得含109CFU/mL菌量的L.plantarumDMDL 9010懸浮液。同理,取1.2.1所制備的L.plantarumDMDL 9010凍干粉按照1∶100 (g/mL)溶解于經(jīng)滅菌處理后的生理鹽水中制得含107CFU/mL菌量的L.plantarumDMDL 9010懸浮液。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方式Table 1 Experiment animal grouping and feeding

1.2.3 大鼠食物攝取和體質(zhì)量指標(biāo) 70 d動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間,每天觀察受試小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài),每7 d稱量大鼠體體重1次,并分別在實(shí)驗(yàn)第7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d稱重喂食量和剩余食量,計(jì)算日攝食量,并計(jì)算飼料利用率,如公式(1)所示:

式(1)

1.2.4 樣本采集 分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第28、56、70 d,禁食不禁水12 h后,每組大鼠隨機(jī)抽取5只,28、56 d的大鼠剪尾取血,70 d的大鼠處死后腹腔取血,以上血樣均37 ℃放置1 h,4 ℃放置2 h,于4 ℃、3000 r/min離心10 min,制備血清,-20 ℃保存。

1.2.5 大鼠脂質(zhì)水平的測(cè)定

1.2.5.1 大鼠血脂水平的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定血清中總膽固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量,并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerotic index,AI),如公式(2)所示:

式(2)

1.2.5.2 大鼠肝臟脂質(zhì)水平的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)70 d處死大鼠分離肝臟,稱重后取肝左葉,經(jīng)脫水,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,用LEICA DM5000B普通光學(xué)顯微鏡觀察(×400)。根據(jù)Folch等[19]方法提取肝臟脂質(zhì)。將一片肝(50 mg)置于試樣瓶中,加入10 mL氯仿∶甲醇(2∶1,V/V)混合液,振蕩混勻,37 ℃保溫30 min,離心(80000 r/min,10 min,4 ℃),收集氯仿層至新EP管中,加6 mL生理鹽水,離心(80000 r/min,10 min,4 ℃)。重復(fù)1次上述步驟后,收集底層氯仿層液體,用氮吹儀吹干,加入異丙醇:Triton-100(9∶1,V/V)混合液0.8 mL復(fù)溶,漩渦振蕩2 min,加1.2 mL蒸餾水,再漩渦振蕩2 min所得溶液為提取的肝組織總脂。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定大鼠肝臟TC、TG含量。

1.2.5.3 大鼠糞便中脂質(zhì)水平的檢測(cè) 在第70 d連續(xù)3 d收集大鼠的糞便并干燥至恒重,大鼠糞便中總脂肪提取方法同1.2.5.2所示。參照Carr等[20]方法提取大鼠糞便中膽汁酸(TBA):稱取0.5 g干糞用10 mL無(wú)水乙醇80 ℃提取3次,蒸干后加10 mL石油醚溶解,棄上清,將沉淀用10 mL含2% Triton X-100的乙醇溶解,振蕩15 min,取上層液于90 ℃下蒸干得沉淀,最后用10 mL蒸餾水溶解,所得溶液為提取的糞便總膽汁酸。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定大鼠糞便中TC、TBA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum DMDL 9010對(duì)大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)和體重的影響

從表2可以看出,大鼠的初始體重和血脂差異不顯著(p>0.05),大鼠的日體重增加在3.34～3.85 g/d之間,日均攝食量在24.19～26.36 g/d,飼料利用率在13.89～15.13%之間,各實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。相比模型組,DMDL 9010高組的日均體重增加量和飼料利用率都較低,而DMDL 9010低組的日均攝食量和飼料利用率都較高,原因可能是灌胃的高劑量的乳酸菌增加了腸道菌群,改善了腸道環(huán)境,從而減輕了大鼠的肥胖程度,而灌胃低劑量的乳酸菌增加了腸道蠕動(dòng),增強(qiáng)了食欲。Lee等[21]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌具有良好的耐酸、耐膽鹽和膽鹽水解酶活性的能力,這表明該菌株通過(guò)胃通道并到達(dá)小腸中能夠生存,從而表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呈現(xiàn)出類似的生長(zhǎng)發(fā)育模式,也說(shuō)明L.plantarumDMDL 9010對(duì)大鼠并沒(méi)有毒副作用,與Park等[22]的研究結(jié)果一致。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的攝食量和飼料利用率(M±SD,n=10)Table 2 Food intake and food efficiency of experimental rats

2.2 L. plantarum DMDL 9010對(duì)大鼠血脂水平的影響

在70 d實(shí)驗(yàn)期間,血清中的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平變化示于表3所示。

表3 實(shí)驗(yàn)SD大鼠血脂水平的比較(mmol/L)Table 3 Comparison of the serum lipid levels in experimental SD rats(mmol/L)

28 d時(shí)DMDL 9010高組和DMDL 9010低組的血清TC均介于模型組和正常組之間,且DMDL 9010高組的TC相對(duì)模型組具有顯著性降低(p<0.05);56 d時(shí)DMDL 9010高組的血清TC相對(duì)模型組降低了23.03%,并且差異顯著(p<0.05);70 d時(shí)DMDL 9010高組血清TC水平稍低于模型組(p<0.05)。結(jié)果說(shuō)明:一定劑量的L.plantarumDMDL 9010可以顯著降低機(jī)體血清TC含量,并隨攝入時(shí)間的延長(zhǎng),該作用更穩(wěn)定。

28 d時(shí),模型組的血清TG相比于正常組有所增加,而陽(yáng)性組、DMDL 9010高組和DMDL 9010低組的血清TG水平與正常組類似;56 d和70 d喂養(yǎng)后DMDL 9010高組和DMDL 9010低組的TG與模型組有較輕微的降低且無(wú)太大的差別,DMDL 9010高組的血清TG含量最低,但是各組之間并無(wú)顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果說(shuō)明，L.plantarumDMDL 9010的攝入隨著攝入時(shí)間的延長(zhǎng)降低機(jī)體血清TG含量的作用具有一定的效果,但效果并不顯著。

28 d時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的血清HDL-C結(jié)果差異不顯著(p>0.05)。56 d時(shí)相對(duì)于模型組,DMDL 9010低組的血清HDL-C含量下降10.91%,但差異并不顯著(p>0.05)。70 d時(shí)相對(duì)正常組,模型組的血清HDL-C含量具有顯著性降低,陽(yáng)性組、DMDL 9010高組和DMDL 9010低組相對(duì)模型組的HDL-C有一定程度的升高,但沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果說(shuō)明:攝入L.plantarumDMDL 9010未能引起HDL-C水平的顯著變化,這可能與該菌的降膽固醇機(jī)制有關(guān),但攝入一定量的L.plantarumDMDL 9010可能對(duì)維持機(jī)體HDL-C水平具有一定作用。這與Fukushima等[23]和Chiu等[24]的研究結(jié)果一致,Fukushima和Chiu研究植物乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌均具有降低HDL-C的作用。28 d時(shí)模型組血清LDL-C相對(duì)正常組具有顯著性升高(p<0.05),相對(duì)于模型組、DMDL 9010高組和DMDL 9010低組的血清LDL-C含量有所下降,但無(wú)顯著性差異。56 d和70 d時(shí)DMDL 9010高組和DMDL 9010低組的血清LDL-C均介于模型組和正常組之間,血清LDL-C相對(duì)于模型組分別降低37.31%和28.00%(p<0.05)。結(jié)果說(shuō)明:攝入L.plantarumDMDL 9010短期內(nèi)可以降低機(jī)體血清LDL-C水平,盡管隨著時(shí)間的延長(zhǎng)效果并不明顯,重要的是L.plantarumDMDL 9010可控制血清LDL-C水平。

按照1.2.5.1的公式計(jì)算五組大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI),分析其隨灌胃時(shí)間變化情況,結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前和實(shí)驗(yàn)第28 d時(shí),各實(shí)驗(yàn)組大鼠的AI沒(méi)有顯著差異。但隨著實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行,第56 d和第70 d時(shí),各高脂飲食喂養(yǎng)組的AI均明顯高于普通飼料喂養(yǎng)組,且有顯著性差異(p<0.05),說(shuō)明長(zhǎng)期飼喂高脂飼料可能會(huì)增加SD大鼠動(dòng)脈硬化的幾率。比較發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)第56 d和第70 d時(shí),灌胃高劑量L.plantarumDMDL 9010菌懸液的AI低于高脂模型組。結(jié)果說(shuō)明，L.plantarumDMDL 9010的攝入可能具有一定的調(diào)節(jié)動(dòng)脈硬化的功效,從而降低機(jī)體動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn),且具有持續(xù)性。

圖1 植物乳桿菌DMDL 9010對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of L. plantarum DMDL 9010 on the atherosclerosis index of experimental rats

2.3 肝臟病理切片觀察

各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟病理切片經(jīng)HE染色,在光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察結(jié)果如圖2所示。正常組大鼠肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性,肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,細(xì)胞界限清楚,呈索狀排列。高脂模型組出現(xiàn)中到重度程度的小泡性脂肪變性,肝臟內(nèi)脂肪含量增高,細(xì)胞排列紊亂。DMDL 9010高組大鼠肝臟變性有一定程度上地減輕,表現(xiàn)為脂變肝細(xì)胞數(shù)量減少,脂滴減少或消失,其中DMDL 9010低組與陽(yáng)性組的類似,DMDL 9010高組脂肪變性的修復(fù)最為明顯。結(jié)果表明1 mL(100 g bw d)的阿托伐他汀和109CFU/mL的L.plantarumDMDL 9010懸浮液對(duì)高脂飲食大鼠的脂肪變性具有良好的改善作用。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟病理切片觀察(×400)Fig.2 Pathological examination of hepatic tissue slices from experimental rats

2.4 L. plantarum DMDL 9010對(duì)大鼠肝臟和糞便中血脂水平的影響

2.4.1L.plantarumDMDL 9010對(duì)大鼠肝臟血脂水平的影響 各實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟脂質(zhì)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。高脂飼料喂養(yǎng)的模型組大鼠肝臟中TC和TG水平高于普通飼料喂養(yǎng)的正常組,具有顯著性差異(p<0.05),說(shuō)明飲食來(lái)源中過(guò)高的膽固醇會(huì)在肝臟中蓄積。乳酸菌組的TC較模型組有所降低,其中陽(yáng)性組、DMDL 9010高組和DMDL 9010低組大鼠肝臟TC含量較模型組分別降低了20.57%、33.20%和24.48%(p<0.05),說(shuō)明阿托伐他汀和L.plantarumDMDL 9010都能有效抑制肝臟中TC的蓄積。陽(yáng)性組和乳酸菌組的TG較模型組有所降低,其中DMDL 9010高組的TG較模型組降低40.86%,具有顯著性差異(p<0.05),說(shuō)明高劑量DMDL 9010對(duì)降低肝臟中甘油三酯的效果較為明顯。

圖3 實(shí)驗(yàn)組大鼠肝脂肪含量Fig.3 Hepatic lipid content in experimental rats

2.4.2L.plantarumDMDL 9010對(duì)大鼠糞便血脂水平的影響 各實(shí)驗(yàn)組大鼠糞便中TC和TBA含量如圖4所示。各高脂飼料喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組大鼠的糞便膽固醇含量均明顯高于普通飼料喂養(yǎng)的正常組,且有顯著性差異(p<0.05),說(shuō)明飲食中含量過(guò)高的膽固醇無(wú)法被吸收,隨糞便排出體外。陽(yáng)性組和DMDL 9010高組相對(duì)模型組顯著升高,陽(yáng)性組和DMDL 9010高組由糞便排出的膽固醇分別高出模型組18.82%、23.70%,說(shuō)明阿托伐他汀和高劑量植物乳桿菌DMDL9010能夠促進(jìn)膽固醇的排泄。由于膽固醇是合成TBA的前體物質(zhì),促進(jìn)TBA在腸道的排泄是降低體內(nèi)膽固醇代謝的主要途徑。比較發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠糞便的膽汁酸含量均高于普通飼料喂養(yǎng)的正常組,且乳酸菌組大鼠TBA的排泄量比模型組都顯著升高(p<0.05),其中DMDL 9010高組TBA代謝量較模型組高出70.18%,說(shuō)明灌胃高劑量DMDL9010菌懸液能有效增加大鼠TBA的排泄量,從而減少血清中膽固醇含量。

在我們的研究中,DMDL 9010高組大鼠的糞便TC和TBA的變化可能是L.plantarumDMDL 9010抑制膽汁鹽的在肝腸中循環(huán)吸收引起的。飲食中補(bǔ)充膽固醇會(huì)導(dǎo)致在其在肝臟中的積累,從而導(dǎo)致增加動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。此外,L.plantarumDMDL 9010可浸潤(rùn)肝細(xì)胞的脂肪,并一定程度的降低囊泡脂肪變性,該發(fā)現(xiàn)與Xie等[25]的研究是一致的。病理切片清楚地指出肝細(xì)胞的脂質(zhì)在減少(圖2),而且DMDL 9010高組和DMDL 9010低組肝臟中TC和TG水平顯著下降(表3)(p<0.05)。糞便中TC和TBA的排泄變化指出與攝入L.plantarumDMDL 9010有顯著關(guān)系(圖4),過(guò)多的膽固醇主要是消除通過(guò)轉(zhuǎn)化為膽汁酸。該結(jié)果表明,L.plantarumDMDL 9010可能在通過(guò)增加糞便的TC和TBA的含量從而有效抑制膽固醇的積累。肝臟中TC可促進(jìn)血清膽固醇的進(jìn)入,從而降低血清膽固醇(見(jiàn)圖1)。之后膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸,借助于肝腸循環(huán),大多數(shù)結(jié)合TBA重吸收,而未結(jié)合的則排入糞便。如果TBA重吸收時(shí)由于L.plantarumDMDL 9010而受阻,那么更多的TBA會(huì)在糞便排出體外,而少量將被回收到肝臟。因此,L.plantarumDMDL 9010降低膽固醇水平可能是由于在肝腸循環(huán)過(guò)程中TBA重吸收被抑制,從而成為游離TBA在糞便中排出體外。L.plantarumDMDL 9010的降膽固醇效果可能是由于增加了糞便TC和TBA,而不是將膽固醇從血液轉(zhuǎn)移到肝臟,這些結(jié)果與Park等[22]研究相似。

圖4 實(shí)驗(yàn)組大鼠糞便中膽固醇和膽汁酸含量Fig.4 Fecal lipid content and total bile acid in experimental rats

3 結(jié)論

L.plantarumDMDL 9010是一種通過(guò)在SD大鼠中降低血清TC和LDL-C的濃度并增加肝膽固醇和糞便TBA的排出,從而降低與膽固醇有關(guān)的心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的益生菌。因此,SD大鼠的肝臟形態(tài)學(xué)變化和肝組織病理學(xué)切片觀察可以驗(yàn)證該效果。植物乳桿菌DMDL 9010也顯著地表現(xiàn)出亞硝酸鹽降解能力,這表明L.plantarumDMDL 9010與健康的腸道環(huán)境息息相關(guān)。該微生物的亞硝酸降解產(chǎn)物有參與胃腸系統(tǒng),包括保持血管張力、參與免疫反應(yīng)、傳遞神經(jīng)信號(hào)和放松腸平滑肌的許多生理功能。因此,我們可以推斷,L.plantarumDMDL 9010是提高肝腸循環(huán)的益生菌,同時(shí)將需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證L.plantarumDMDL 9010在人體中的作用。此外,潛在的機(jī)制可能是不同的,并需要通過(guò)探索轉(zhuǎn)錄因子、膽固醇受體、參與這一脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵酶來(lái)驗(yàn)證可能的機(jī)制。

[1]Moodie D S. The global burden of cardiovascular disease[J]. Congenital heart disease,2016,11(3):213-213.

[2]Durán J,Peloquin C,Zhang Y,et al. Primary prevention of myocardial infarction in rheumatoid arthritis using sspirin:A case-crossover study and a propensity score-matched cohort study[J]. The Journal of Rheumatology,2017,44(4):418-424.

[3]Aazmi S,Teh L K,Ramasamy K,et al. Comparison of the anti-obesity and hypocholesterolaemic effects of single Lactobacillus casei strain Shirota and probiotic cocktail[J]. International Journal of Food Science and Technology,2015,50(7):1589-1597.

[4]Richardson D P,Eggersdorfer M. Opportunities for product innovation using authorised European Union health claims[J]. International Journal of Food Science and Technology,2015,50(1):3-12.

[5]Xiong Z Q,Wang Q H,Kong L H,et al. Improving the activity of bile salt hydrolases in Lactobacillus casei based on in silico molecular docking and heterologous expression[J]. Journal of dairy science,2017,100(2):975-980.

[6]Zhang F,Qiu L,Xu X,et al. Beneficial effects of probiotic cholesterol-lowering strain of Enterococcus faecium WEFA23 from infants on diet-induced metabolic syndrome in rats[J]. Journal of dairy science,2017,100(3):1618-1628.

[7]Wan L Y M,Chen Z J,Shah N P,et al. Modulation of intestinal epithelial defense responses by probiotic bacteria[J]. Critical reviews in food science and nutrition,2016,56(16):2628-2641.

[8]Fong F L Y,Shah N P,Kirjavainen P,et al. Mechanism of action of probiotic bacteria on intestinal and systemic immunities and antigen-presenting cells[J]. International reviews of immunology,2016,35(3):179-188.

[9]Shaper A G,Jones K W,Jones M,et al. Serum lipids in three nomadic tribes of northern Kenya[J]. The American journal of clinical nutrition,1963,13(3):135-146.

[10]Mann G V,Spoerry A. Studies of a surfactant and cholesteremia in the Maasai[J]. The American Journal of Clinical Nutrition,1974,27(5):464-469.

[11]Kaya Y,K?k M,?ztürk M. Molecular cloning,expression and characterization of bile salt hydrolase from Lactobacillus rhamnosus E9 strain[J]. Food Biotechnology,2017,31(2):128-140.

[12]Huang Y,Wu F,Wang X,et al. Characterization ofLactobacillusplantarumLp27 isolated from Tibetan kefir grains:a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects[J].Journal of Dairy Science,2013,96(5):2816-2825.

[13]Thompson L U,Jenkins D J,Amer M A,et al. The effect of fermented and unfermented milks on serum cholesterol[J]. The American journal of clinical nutrition,1982,36(6):1106-1111.

[14]Gilliland S E,Walker D K. Factors to consider when selecting a culture ofLactobacillusacidophilusas a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans[J]. Journal of Dairy Science,1990,73(4):905-911.

[15]Hongpattarakere T,Rattanaubon P,Buntin N. Improvement of freeze-driedLactobacillusplantarumsurvival using water extracts and crude fibers from food crops[J]. Food and Bioprocess Technology,2013,6(8):1885-1896.

[16]Jones M L,Tomaro-Duchesneau C,Prakash S. The gut microbiome,probiotics,bile acids axis,and human health[J]. Trends in Microbiology,2014,22(6):306-308.

[17]Fei Y,Liu D,Luo T,et al. Molecular characterization ofLactobacillusplantarumDMDL 9010,a strain with efficient nitrite degradation capacity[J]. Plos one,2014,9(11):e113792.

[18]Lee D K,Jang S,Baek E H,et al. Lactic acid bacteria affect serum cholesterol levels,harmful fecal enzyme activity,and fecal water content[J]. Lipids in Health and Disease,2009,8(1):1.

[19]Folch J,Lees M,Sloane-Stanley G H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J].Journal of Biological Chemistry,1957,226(1):497-509.

[20]Carr T P,Andresen C J,Rudel L L. Enzymatic determination of triglyceride,free cholesterol,and total cholesterol in tissue lipid extracts[J]. Clinical Biochemistry,1993,26(1):39-42.

[21]Lee Y K,Salminen S. The coming of age of probiotics[J]. Trends in Food Science and Technology,1995,6(7):241-245.

[22]Park Y H,Kim J G,Shin Y W,et al. Effect of dietary inclusion ofLactobacillusacidophilusATCC 43121 on cholesterol metabolism in rats[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2007,17(4):655-662.

[23]Fukushima M,Nakano M. Effects of a mixture of organisms,LactobacillusacidophilusorStreptococcusfaecalison cholesterol metabolism in rats fed on a fat-and cholesterol-enriched diet[J].British Journal of Nutrition,1996,76(6):857-867.

[24]Chiu C H,Lu T Y,Tseng Y Y,et al. The effects ofLactobacillus-fermented milk on lipid metabolism in hamsters fed on high-cholesterol diet[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,71(2):238-245.

[25]Xie N,Cui Y,Yin Y N,et al. Effects of twoLactobacillusstrains on lipid metabolism and intestinal microflora in rats fed a high-cholesterol diet[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2011,11(1):53.