范三紅，胡小平

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥赤霉病(Fusarium head blight)是影響全球小麥生產(chǎn)的主要病害，其發(fā)生不僅會引起小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，影響糧食供給安全，同時會導(dǎo)致小麥籽粒的毒素污染，產(chǎn)生威脅人畜生命健康的食品安全問題[1]。赤霉病的發(fā)生通常會使小麥產(chǎn)量減少20%左右，大面積感染時小麥的產(chǎn)量減少可達(dá)50%～60%，甚至絕收。隨著小麥矮稈品種和玉米小麥輪作栽培模式的推廣，我國小麥赤霉病發(fā)生區(qū)域從長江流域向黃淮流域不斷北移，發(fā)生頻率也在不斷增加[2]。2012年，我國爆發(fā)小麥赤霉病大流行，受災(zāi)面積約占全國小麥總面積的一半，造成了小麥產(chǎn)量損失嚴(yán)重[3]。赤霉菌侵染小麥時，病菌產(chǎn)生的多種毒素會在小麥籽粒中累積，其中最主要的成分為脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(deoxynivalenol，DON)及其3-乙酰衍生物(3-ADON)和15-乙酰衍生物(15-ADON)。DON可引起人畜惡心、嘔吐、胃部不適，危害生殖系統(tǒng)，甚至具有致癌、致畸、致突變的危險[4-5]。赤霉菌毒素導(dǎo)致的糧食、食品和飼料污染問題引起了人們極大的關(guān)注，成為農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

小麥赤霉病由禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、梨孢鐮孢菌(F.poae)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、雪腐鐮孢菌(F.nivale)、亞洲鐮孢菌(F.asiaticum)等形成的禾谷鐮孢菌復(fù)合種(Fusariumgraminearumspecies complex，F(xiàn)GSC)引起。由于不同地域氣候不同，引發(fā)赤霉病發(fā)生的優(yōu)勢菌種也有所不同。引起我國小麥赤霉病的主要病原為禾谷鐮孢菌和亞洲鐮孢菌，其中90%以上由禾谷鐮孢菌引起[2]。不同鐮孢菌產(chǎn)生毒素的能力和毒素的種類不同，即便都是禾谷鐮孢菌，不同株系的產(chǎn)毒能力和毒素類型也不盡相同[6]。自上世紀(jì)20世紀(jì)70年代日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)并命名了鐮孢菌毒素DON[7]，研究者一直致力于赤霉菌毒素的合成機(jī)制、影響因素及檢測方法的探索。本文匯總了近年來關(guān)于赤霉菌毒素合成、轉(zhuǎn)運及調(diào)控分子機(jī)制的研究進(jìn)展，并對目前主流的赤霉菌毒素檢測方法進(jìn)行比較分析，以期為赤霉菌毒素的監(jiān)測和防控技術(shù)的研究提供參考。

1 小麥赤霉菌毒素的類別與結(jié)構(gòu)

小麥赤霉菌產(chǎn)生的毒素主要為DON和NIV，以及它們的乙?；苌?，它們均為倍半萜衍生物，屬于單端孢霉烯類化合物(trichothecene)。單端孢霉烯類化合物最早從粉紅單端孢霉分離獲得，并存在于多種鐮孢菌中，它們合成過程中均出現(xiàn)單端孢霉二烯中間體。單端孢霉烯類化合物分為A、B兩類，DON和NIV屬于B類。A類和B類化合物的主要區(qū)別在于B類化合物的8位和7位碳原子上分別存在一個羰基和一個羥基，而對應(yīng)官能團(tuán)在A類化合物中不存在[8-9]。DON的化學(xué)名為12,13-環(huán)氧-3a,7a,15-三羥基單端孢霉烯-9-烯-8-酮，其3位和15位碳原子上的羥基與乙?；纬甚ユI產(chǎn)生了DON的兩種衍生物3-ADON和15-ADON。NIV的結(jié)構(gòu)與DON的結(jié)構(gòu)極為類似，最主要的區(qū)別在于NIV在4位多出了一個羥基。NIV也存在兩種乙?；难苌?-ANIV和4,15-diANIV。NIV的俗名雪腐鐮孢菌烯醇，而DON的俗名為脫氧雪腐鐮孢菌烯醇，所謂的脫氧就是指DON與NIV相比4位的羥基被氫取代。從英國分離到的76個產(chǎn)生DON的禾谷鐮孢菌株中，95%為15-ADON化學(xué)型，5%為3-ADON化學(xué)型[10]。從我國分離到的60株赤霉菌中禾谷鐮孢菌均為15-ADON化學(xué)型，亞洲鐮孢菌為3-ADON或NIV化學(xué)型，NIV化學(xué)型鐮孢菌產(chǎn)生毒素的能力遠(yuǎn)低于DON化學(xué)型[6]。通常液體培養(yǎng)獲得的毒素為乙酰化衍生物，但侵染植物時會出現(xiàn)去乙酰化的毒素，這可能是病原或植物產(chǎn)生的酯酶催化對應(yīng)乙?；獾慕Y(jié)果[11]。

圖1 DON、NIV及其乙酰化衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)[12]

2 鐮孢菌毒素合成相關(guān)基因

鐮孢菌毒素合成相關(guān)基因最早由美國農(nóng)業(yè)部研究者從擬枝鐮孢菌(F.sporotrichioides)中發(fā)現(xiàn)，該鐮孢菌可產(chǎn)生T2毒素[13]。后來研究者從禾谷鐮孢菌中獲得了類似的發(fā)現(xiàn)，并有了更深入的研究[14]。參與鐮孢菌毒素合成的基因有12～16，不同菌種甚至株系有所差異[11,15]。其中有12個基因形成一個 Tri5的基因簇(圖2)，該基因簇依次包含 Tri8、7、3、4、6、5、10、9、11、12、13、14。除此之外還包括 Tri1、 Tri16、 Tri15和 Tri101，其中 Tri1和 Tri16相鄰(表1)。與擬枝鐮孢菌相比，禾谷鐮孢菌均缺失了 Tri16基因，且不同化學(xué)型的禾谷鐮孢菌毒素的合成基因還有所不同，與NIV型菌株不同，DON型菌株的 Tri7和 Tri13發(fā)生缺失或突變[16]。其中 Tri5編碼單端孢霉二烯合成酶[17]，該酶催化單端孢霉烯類毒素共同前體-單端孢霉二烯的形成，是毒素合成的關(guān)鍵酶。 Tri1、Tri11、Tri13、Tri14編碼P450家族單加氧酶，催化環(huán)核及側(cè)鏈碳原子的羥化。 Tri7、Tri3、Tri16、Tri101編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)羥基與乙?；噙B形成酯鍵。 Tri12編碼外排泵，負(fù)責(zé)毒素的外排[18-19]。 Tri8編碼分泌型酯酶[12,20]，水解乙?；舅厣系囊阴；?Tri6、Tri10、Tri15編碼轉(zhuǎn)錄因子，其中 Tri6和 Tri10是調(diào)節(jié)毒素的合成關(guān)鍵[21-22]。Tri基因在禾谷鐮孢菌、黃色鐮孢菌及亞洲鐮孢菌中具有高度共線性和一致性，但具體到每一個基因，不同鐮孢菌的序列具有差異，這也是不同鐮孢菌產(chǎn)生毒素的種類和數(shù)量存在差異的主要原因。

圖2 擬枝鐮孢菌與不同化學(xué)型禾谷鐮孢菌的單端孢霉烯類毒素合成基因簇比較[11]

基因名Genename功能Function蛋白家族Proteinfamily參考文獻(xiàn)ReferenceTri8C-3orC-15esteraseSecretoryesterase[12,20]Tri7C-4acetyltransferaseMembranebandedO-acetyltransferase[16]Tri3C-15acetyltransferase15-O-acetyltransferase[23]Tri4C-2hydroxylaseP450mono-oxygenase[24,25]Tri6transcriptionfactorC2H2zincfingerprotein[21]Tri5TrichodienesynthaseTrichodienesynthaseTri5[22]Tri10transcriptionfactorFungaltranscriptionfactor2[22]Tri9UnknownTRI9-Tri11C-15hydroxylaseP450mono-oxygenase[26]Tri12EffluxpumpTrichodieneeffluxpump[18,19]Tri13C-4hydroxylaseP450mono-oxygenase[16]Tri14UnknownUnkown[27]Tri1C-8hydroxylaseP450mono-oxygenase[28]Tri16C-8acetyltransferaseTransferasefamily[18,19]Tri15transcriptionfactorC2H2zincfingerprotein[29]Tri101C-3acetyltransferaseTransferasefamily[29]

3 小麥鐮孢菌毒素合成通路

鐮孢菌毒素DON和NIV為倍半萜衍生物，其合成前體為包含15個碳原子的法尼基焦磷酸(FPP)，F(xiàn)PP不僅是單端孢霉烯類毒素合成的前體，也是甾醇、泛醌、多萜醇等萜類衍生物合成的前體。FPP自身的合成過程在所有生物體內(nèi)具有一致性，單個FPP環(huán)化可形成多種不同的碳骨架，并在此基礎(chǔ)上衍生出不同的倍半萜及衍生物。DON和NIV的合成可以分為6個階段(圖3)。第1階段為FPP環(huán)化形成單端孢霉二烯(TDN)，TDN是整個合成途徑中第一個被鑒定的環(huán)化中間體，由 Tri5基因編碼產(chǎn)物催化FPP環(huán)化產(chǎn)生[22]。第2階段為TDN的氧化，TDN的2、3、和11位的碳原子上單加氧形成羥基，在12和13位碳原子間加氧形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)，4步反應(yīng)均由 Tri4編碼的P450家族單加氧酶催化完成[24-25]，最終形成異構(gòu)單端孢霉三醇(12,13-epoxy-9,10-trichoene-2,3,11-triol，Isotrichotriol)。第3階段為異構(gòu)單端孢霉三醇的再環(huán)化，該過程為2-和11-位羥基自發(fā)脫水成環(huán)反應(yīng)，形成了第一個單端孢霉烯化合物異構(gòu)木霉菌醇(isotrichodermol)。第4階段為麗赤殼菌素(calonectrin，CAL)的形成，該過程由 Tri101、 Tri11和 Tri3編碼產(chǎn)物催化完成， Tri101和 Tri3編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶[23,26]，催化將乙酰基轉(zhuǎn)移到3和15位的羥基上形成酯鍵。3位上的羥基在第2階段的氧化過程中已經(jīng)形成，15位的羥基則是在 Tri11編碼的P450單加氧酶的催化下形成[26]。第5階段為DON及其衍生物的形成，該階段CAL在 Tri1編碼的P450蛋白催化下在7-和8-位進(jìn)行加氧形成兩個羥基[28]，然后自發(fā)形成3，15-diADON，再在 Tri8編碼的分泌型酯酶的催化下，水解掉3或15位的乙?；纬?-ADON或15-ADON[12]，最后在病菌或植物酯酶的催化下形成DON。第6階段為NIV及其衍生物的形成，禾谷鐮孢菌中其形成NIV的起始物為3，15-diADON。在 Tri13編碼的單加氧酶催化下，3，15-diADON的4位碳原子上加氧形成羥基，生成3，15-diANIV，在 Tri7編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下在4位羥基形成乙酰酯，生產(chǎn)3，4，15-triANIV[16]。最后在 Tri8以及其它真菌或植物酯酶催化下水解不同酯鍵形成NIV和其他形式乙?；苌铩?/p>

4 小麥鐮孢菌毒素的轉(zhuǎn)運

包括DON、NIV在內(nèi)的單端孢霉烯類毒素會抑制人及動物細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)合成等過程[30]，也會抑制宿主植物細(xì)胞代謝以達(dá)到快速擴(kuò)散的目的。為什么DON和NIV類毒素不影響絲狀真菌自身生長發(fā)育？要回答這個問題需要弄清楚毒素的合成和轉(zhuǎn)運過程。2015年Jon Menke研究DON合成關(guān)鍵酶Tri4和Tri1時發(fā)現(xiàn)，融合有GFP的Tri4和融合有RFP的Tri1共定位于一個獨特“細(xì)胞器”之中，并將其命名為“毒素體”(toxisome)[31]。進(jìn)一步研究表明，經(jīng)典的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的萜類合成關(guān)鍵酶Hmp1也定位于“毒素體”之中，暗示毒素體可能來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Tri12蛋白為毒素外排泵，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Tri12定位于分泌小泡和質(zhì)膜，并且有少量小泡和毒素體有所重疊，于是提出毒素合成運輸?shù)哪Ｐ?圖4)。2017年Marike Johanne Boenisch等的研究證明，毒素體源于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異化[32]，這一獨特的用于特殊次生物質(zhì)代謝的“毒素體”類似于肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞中形成的特化滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(organized smooth ER，OSER)，參與解毒、分泌等過程。2017年Liu等研究發(fā)現(xiàn)，HSP70蛋白FgSsb和FgSsz與它們的互作蛋白FgZuo可形成復(fù)合體，輔助微管蛋白FgTub2和小泡融合調(diào)節(jié)蛋白FgVam7的折疊[33]。它們的缺失會導(dǎo)致DON毒素合成受阻，從而證明DON毒素的合成與小泡運輸相關(guān)。小麥鐮孢菌毒素合成最后一個酶Tri8為分泌型酯酶，催化3，15-diADON上乙?；乃?，這意味著DON毒素以前體形式3，15-diADON分泌，然后在細(xì)胞外被Tri8活化，這也可以看作是毒素分泌型絲狀真菌自我保護(hù)的一種機(jī)制。

5 小麥鐮孢菌毒素合成的調(diào)控

在鐮孢菌毒素合成基因簇中包含兩個轉(zhuǎn)錄因子Tri6和Tri10，基因敲除實驗結(jié)果表明兩者的缺失會導(dǎo)致Tri基因不表達(dá)，導(dǎo)致DON毒素不能被合成[34]?；蛐酒虲hip-seq實驗結(jié)果表明，Tri6轉(zhuǎn)錄因子可以特異結(jié)合于Tri基因上游啟動子區(qū)，調(diào)節(jié)Tri基因的表達(dá)[35]。已有研究顯示，氮源、pH、活性氧環(huán)境因素會影響通過Tri6和Tri10調(diào)節(jié)Tri基因表達(dá)[36,37]。與其他毒素產(chǎn)生真菌類似，鐮孢菌的毒素合成過程受cAMP-PKA信號通路調(diào)控。2016年Jiang等勾勒出了鐮孢菌毒素合成的cAMP-PKA調(diào)控模型[38]。除Tir6、Tri10外轉(zhuǎn)錄因子外，AreA也參與Tri基因的調(diào)控[39]，其中Tri6和Tri10間存在互作，AreA和Tri10間存在互作，Tri6和AreA可通過與Tri基因上游順式作用元件的互作實現(xiàn)對Tri基因的調(diào)控。內(nèi)源和外源cAMP的上調(diào)會激活PKA，PKA會磷酸化Tir6和AreA從而啟動Tri基因的表達(dá)。內(nèi)源cAMP的產(chǎn)生主要依賴于腺苷酸環(huán)化酶FgAC1，該酶的活性又受其互作蛋白FgCAP1的激活[40,41]。FgCAP基因上游存在Tri6結(jié)合位點，Tri6調(diào)控FgCAP的表達(dá)，從而提高細(xì)胞中cAMP的濃度，從而刺激毒素的合成。cAMP的水解主要受PDE1和PDE2的催化，刪除鐮孢菌中PDE2基因會導(dǎo)致cAMP的累積，DON毒素水平顯著上升，而刪除PDE1則影響較小。此外，過量的cAMP會導(dǎo)致 Tri6基因表達(dá)的自抑制，而其他Tri基因的表達(dá)則上調(diào)。

圖3 小麥赤霉菌單端孢霉烯類毒素合成通路[11,15]

圖4 赤霉菌毒素的合成和外排機(jī)制[31]

圖5 赤霉菌毒素合成基因調(diào)控模型[38]

6 赤霉菌毒素檢測方法比較

隨著人們對糧食和飼料毒素污染問題的持續(xù)關(guān)注，赤霉菌毒素檢測技術(shù)在不斷演進(jìn)，毒素檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大。赤霉病抗病育種、赤霉病化學(xué)農(nóng)藥研發(fā)、赤霉菌毒素預(yù)測預(yù)報等研究領(lǐng)域不僅需要高靈敏度、高分辨率的赤霉菌毒素檢測技術(shù)，糧食收購、食品加工、飼料加工和家畜養(yǎng)殖企業(yè)對便捷、快速、準(zhǔn)確的毒素檢測方法的需求更迫切。

根據(jù)分析原理的不同，目前的檢測方法主要分為兩大類，第一類基于色譜分離技術(shù)，第二類基于酶聯(lián)免疫技術(shù)[42]。前者包括早期的薄層色譜法(TLC)和后來的高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)，目前主要采用液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS)，液相色譜和氣相色譜的檢測靈敏度高且分辨率好，可通過質(zhì)譜儀的聯(lián)用鑒定毒素的新變種，兩者的主要缺點是需要專業(yè)設(shè)備及專業(yè)人員?；诿嘎?lián)免疫的測定方法首先需要制備出針對毒素的特異多克隆或單克隆抗體[43]，抗體對毒素的專一性決定了最終檢測方法對不同毒素的分辨率。目前國內(nèi)外均有商品化的單克隆抗體用于DON毒素的檢測?；诿嘎?lián)免疫的方法又可以分為兩種主要的方案，一種為酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，一種為膠體金免疫層析(GICA)，前者通常開發(fā)成商品化的試劑盒，可對大量樣品進(jìn)行高通量檢測，檢測靈敏度可達(dá)0.9 μg·kg-1。后者主要制作成檢測卡，通過類似受孕試紙的方法直觀的給出定性結(jié)果，當(dāng)然也可以結(jié)合熒光檢測儀進(jìn)行定量分析。

7 展 望

到目前為止，小麥赤霉菌毒素合成過程中每個基因( Tri9和 Tri14除外)的功能已經(jīng)明確，毒素生物合成生化代謝通路、毒素的轉(zhuǎn)運與外排、毒素的胞外激活及毒素合成的cAMP-PKA調(diào)控通路已基本闡明。如何在深刻理解赤霉菌毒素合成機(jī)制基礎(chǔ)上，在大力倡導(dǎo)合理使用農(nóng)藥的背景下研發(fā)出小麥赤霉病和赤霉菌毒素污染的預(yù)防與控制新技術(shù)是農(nóng)學(xué)、植保等領(lǐng)域?qū)＜颐媾R的挑戰(zhàn)。

表2 DON毒素檢測方法比較Table 2 Comparison of detection methods for DON

解決小麥赤霉病及其引起的毒素污染問題的首選方案是抗病育種，培育出的新品種不僅要抗赤霉病，也要累積毒素。傳統(tǒng)上抗病品種的篩選主要以產(chǎn)量為主要指標(biāo)，但產(chǎn)量沒有明顯降低并不意味著毒素或者毒素類似物沒有在籽粒中累積，應(yīng)該將抑制赤霉菌毒素累積的能力作為品種篩選的標(biāo)準(zhǔn)之一。 Tri101為赤霉菌毒素合成通路中的一個基因，該基因編碼產(chǎn)物可催化DON形成乙?；苌?，從而降低了其對植物的毒性。研究者將赤霉菌的 Tri101基因?qū)胄←満痛篼溨衃51-53]，提高了植物對赤霉菌和赤霉菌毒素的抗性和耐受性，為作物赤霉菌抗病育種提供了一個新思路?？钩嗝共〉男←溨写嬖谔腔腄ON，糖基化修飾降低了DON對植物細(xì)胞的毒性[54]，如何提高作物DON糖基化酶的活力則是提高作物抗性的另一策略。赤霉菌毒素降解菌的篩選一直是飼料工業(yè)領(lǐng)域的研究熱點，國內(nèi)外研究者已經(jīng)篩選到多種DON毒素降解菌[55-57]，如果將這些降解菌中的關(guān)鍵酶編碼基因?qū)胄←?，則可能提高小麥的赤霉病抗性，大幅減少赤霉菌毒素在小麥籽粒中的累積。

解決上述難題的另一方案是精準(zhǔn)的監(jiān)測預(yù)警及其指導(dǎo)下的適度化學(xué)防控。在目前赤霉病免疫品種缺乏、發(fā)病區(qū)域不斷擴(kuò)大、發(fā)病頻率有所增加的條件下，利用精準(zhǔn)監(jiān)測預(yù)警對小麥赤霉病的發(fā)生進(jìn)行提前預(yù)判，根據(jù)預(yù)測預(yù)報結(jié)果進(jìn)行針對性的適度化學(xué)防控，是降低產(chǎn)量損失、農(nóng)藥污染和毒素污染的有效方案。我們項目組發(fā)明了基于物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的小麥赤霉病預(yù)報器，構(gòu)建了基于云計算的赤霉病監(jiān)測預(yù)警平臺，并在全國主要小麥主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行測試和示范[58]，近4年在陜西省的平均預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。傳統(tǒng)的預(yù)測預(yù)報方法以發(fā)病程度和產(chǎn)量損失為目標(biāo)，隨著人們對赤霉菌毒素危害認(rèn)識的增強，在赤霉病發(fā)病程度預(yù)測的基礎(chǔ)上對赤霉菌毒素污染的程度進(jìn)行預(yù)測與預(yù)警是下一步研究的重要方向。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法同樣以產(chǎn)量損失的挽回程度為目標(biāo)，研究者應(yīng)當(dāng)將化學(xué)農(nóng)藥對赤霉菌毒素累積的影響作為農(nóng)藥篩選的重要考量。由于毒素可輔助赤霉菌的侵染和擴(kuò)散，因而赤霉菌毒素合成過程中的關(guān)鍵酶可以作為新農(nóng)藥開發(fā)的靶標(biāo)，一方面可以抑制赤霉病的發(fā)作，同時也可以阻斷赤霉菌毒素的合成，預(yù)防小麥籽粒的毒素污染。

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