亓翠玲，曹靜樺，何亞軍，李夢(mèng)詩，李倩明，楊 揚(yáng)，王麗京

(廣東藥科大學(xué)，基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是De Bold等[1]于1981年首次在心房肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，是鈉尿肽家族(NPs)被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成員。之后發(fā)現(xiàn)了其他的成員，即腦鈉肽(BNP)[2]、C-型鈉尿肽(CNP)[3]和樹眼鏡蛇性鈉尿肽(DNP)[4]。ANP與細(xì)胞膜上的受體鳥苷酸環(huán)化酶相互作用，發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。ANP最主要的生物學(xué)作用是排鈉利尿，調(diào)節(jié)血壓及參與水鹽平衡等。研究表明ANP還具有其他生物學(xué)功能，如通過減少自由基的生成和抵制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到保護(hù)心肌的作用；通過重塑心肌結(jié)構(gòu)，從而改善心力衰竭的癥狀；還可通過對(duì)子宮血管重塑，對(duì)生殖等發(fā)揮重要作用。但是，ANP對(duì)黑色素瘤生長的作用未見報(bào)道。作者利用C57BL/6J背景的ANP敲除小鼠建立黑色素瘤皮下移植瘤模型，研究ANP對(duì)黑色素瘤生長的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ANP雜合子小鼠(ANP+/-)，雄性2只，雌性6只，6～8周齡，體重18～20 g，由耿建國教授提供。C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，雌性，10只，6～8周齡，體重18～20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2008-0002]。小鼠飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作也在此進(jìn)行[SYXK(粵)2012-0125]，并嚴(yán)格按照廣東藥科大學(xué)動(dòng)物倫理要求進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(福利倫理審查證號(hào)：gdpulac2015014)。

1.2 主要試劑與儀器

B16F10黑色素瘤細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中；Rabbit anti-mouse Ki67抗體及rabbit anti-mouse CD31抗體購自博士德生物工程有限公司；Mouse anti-rabbit IgG購自北京中杉金橋生物有限公司。

主要儀器有PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；全自動(dòng)生物組織包埋機(jī)(PR公司)；烤片機(jī)(PR公司)；石蠟切片機(jī)和冰凍切片機(jī)(德國徠卡儀器公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ANP純合子敲除小鼠的建立

ANP純合子敲除小鼠由ANP雜合子小鼠相互配種構(gòu)建所得。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)ANP基因設(shè)計(jì)了引物：引物1∶5′- CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG -3′；引物2∶5′- CTG TCC AAC ACA GAT CTG ATG -3′；引物3∶5′- CTG TTG CAG CCT AGT CCA CT -3′。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3 min, 94℃ 30 s, 64℃ 1 s, 72℃ 1 s; 35個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物為700 bp。

1.3.2 皮下移植瘤模型的建立

以C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組，ANP敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)數(shù)生長期的黑色素瘤B16F10細(xì)胞，用胰酶消化離心后，用無菌的PBS重懸細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以確定死細(xì)胞數(shù)低于5%后，在小鼠的右上肢腋下皮下接種0.2 mL的黑色素瘤細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)。在接種后第7天每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，移植瘤體積的計(jì)算公式為：0.52×ab2。在腫瘤細(xì)胞接種12 d時(shí)，處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織，并稱重。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色

將小鼠的腫瘤組織石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片脫蠟、水化后，放于3% H2O2-甲醇液中，37℃浸泡30 min以消除內(nèi)源性過氧化酶。PBS清洗3次后，高壓修復(fù)10 min。血清封閉50 min后，加 rabbit anti-mouse Ki67抗體或 rabbit anti-mouse CD31抗體，4℃過夜。PBS清洗3次后，加二抗，37℃孵育50 min。PBS清洗3次后，DAB染色，蘇木素復(fù)染后，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ANP敲除小鼠的鑒定與擴(kuò)群

本實(shí)驗(yàn)所有小鼠均為ANP雜合子小鼠(ANP+/-)，用雄性ANP+/-小鼠與雌性ANP+/-小鼠雜交，子代有雜合子、純合子和野生型三種基因型小鼠。1、2、4和6號(hào)小鼠的電泳條帶大小為700 bp，為純合子小鼠；3號(hào)和5號(hào)小鼠電泳條帶大小為700 bp和434 bp，為雜合子小鼠。接著，用ANP-/-小鼠與ANP-/-小鼠配種，對(duì)ANP-/-小鼠擴(kuò)群。

注：3號(hào)和5號(hào)小鼠條帶分別為700 bp和434 bp，為ANP雜合子小鼠，1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)及6號(hào)小鼠的條帶為700 bp，為ANP敲除純合子小鼠。M：Marker 2000 bp；ANP-/-小鼠有一條帶為700 bp；ANP+/-小鼠有兩條帶，分別為700 bp和434 bp，野生型小鼠有一條帶為434 bp。圖1 ANP基因的鑒定圖Note.Lane 3,5: ANP+/- mice; Lane1, 2，4，6: ANP-/- mice.Fig.1 Identification image of ANP gene

2.2 ANP敲除抑制了黑色素移植瘤的生長

在ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠皮下接種黑色素瘤B16F10細(xì)胞建立黑色素移植瘤模型，7 d后均形成明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。成瘤后，每天測(cè)量腫瘤的長徑和短徑，計(jì)算小鼠的腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)在對(duì)應(yīng)的時(shí)間內(nèi)ANP敲除小鼠的腫瘤體積明顯比C57BL/6J小鼠的腫瘤體積小(見圖2A)。在腫瘤接種12 d時(shí)，用斷頸法處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織并稱重，發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠的腫瘤重量明顯比C57BL/6J小鼠的腫瘤重量輕(見圖2B)。

注：與C57BL/6J小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 ANP敲除對(duì)小鼠黑色素移植瘤的作用Note.Compared with the C57BL/6J mouse，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 The effect of ANP knockout on the transplanted melanoma in mice

2.3 ANP敲除對(duì)黑色素瘤腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤微血管密度的作用

小鼠腫瘤組織石蠟包埋、切片后，用Ki67及CD31抗體檢測(cè)腫瘤組織中增殖的細(xì)胞及血管。對(duì)于增殖細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)，每張切片在400倍光鏡下拍照，每張切片隨機(jī)記錄4～5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)及全部細(xì)胞數(shù)，增殖指數(shù)為增殖細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的比值。發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠腫瘤組織中細(xì)胞增殖指數(shù)明顯比C57BL/6J小鼠少(圖3A)。關(guān)于微血管密度，每張切片在200倍光鏡下拍照，每張切片隨機(jī)記錄4～5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中血管的數(shù)目，發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠腫瘤組織中微血管數(shù)目明顯比對(duì)照組少(圖3B)。

3 討論

ANP是廣泛分布于心臟血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及腎臟組織中由心肌細(xì)胞合成和分泌的激素。ANP主要與NPRA結(jié)合，激活G蛋白和鳥苷酸環(huán)化酶，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷的生成[5-8]，從而利鈉利尿、舒張血管、降低血壓、參與脂質(zhì)代謝及調(diào)節(jié)免疫等[9-12]。近年研究表明ANP還對(duì)纖維化、心肌缺血再灌注損傷等具有重要作用[13-14]。但是，ANP對(duì)腫瘤生長的作用尚未見報(bào)道。

為了確定ANP對(duì)黑色素瘤的作用，本研究利用ANP敲除小鼠建立了黑色素瘤皮下移植模型。利用基因工程小鼠建立腫瘤移植瘤模型具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢(shì)：可以在基因產(chǎn)物的作用完全消除的情況下，研究單個(gè)基因在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)腫瘤的作用，更能模擬腫瘤在人類體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的過程。本實(shí)驗(yàn)所用的基因工程小鼠為ANP敲除小鼠，在ANP敲除小鼠體內(nèi)ANP的功能完全缺失。利用ANP敲除小鼠及其對(duì)照C57BL/6J小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，每組小鼠的腫瘤成功率可達(dá)100%，而且腫瘤生長速度較一致，個(gè)體差異也較小，而且腫瘤長于體表，易于觀察及測(cè)量腫瘤，可以客觀地判斷ANP對(duì)腫瘤生長的作用。

注：與C57BL/6J小鼠比較，**P< 0.01，***P< 0.01。圖3 ANP缺失抑制了腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管形成(Bar=100 μm)Note.Compared with the C57BL/6J mouse，**P< 0.01，***P< 0.001.Fig.3 Deletion of ANP inhibits tumor cell proliferation and tumor angiogenesis in the mice.

本研究利用ANP敲除小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)ANP敲除顯著抑制了黑色素瘤的生長。為了進(jìn)一步確定ANP敲除抑制黑色素瘤的作用，我們用免疫組化檢測(cè)了腫瘤組織中增殖的細(xì)胞及微血管密度，發(fā)現(xiàn)ANP敲除后顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖及微血管的密度。所以，ANP敲除可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及減少微血管的數(shù)目，從而抑制了黑色素皮下移植瘤的生長。

綜上所述，ANP缺失顯著抑制了黑色素瘤的生長，但其分子機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。進(jìn)一步探討ANP與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，將對(duì)于理想的抗腫瘤治療靶點(diǎn)及判斷患者預(yù)后具有重要意義，而且為ANP作為治療腫瘤患者的新型藥物提供了重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] de Bold AJ, Borenstein HB, Veress AT, et al. A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extracts in rats [J]. Life Sci，1981, 28(1):89-94.

[2] Sudoh T, Kangawa K, Minamino N, et al. A new natriuretic peptide in porcine brain [J]. Nature, 1988, 332(6159): 78-81.

[3] Sudoh T, Minamino N, Kangawa W, et al. C-type natriuretic peptide (CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168(2): 863-870.

[4] Schweitz H, Vigne P, Moinier D, et al. A new member of the natriuretic peptide family is present in the venom of the green mamba (dendroaspis angusticeps) [J]. J Biol Chem, 1992, 267(20): 13928-13932.

[5] Suga S, Nakao K, Hosoda K, et al. Receptor selectivity of natriuretic peptide family, atrial natriuretic peptide,brain natriureticpeptide, and C-type natriuretic peptide [J]. Endocrinology, 1992, 130(1): 229-239.

[6] Calderone A, Thaik CM, Takahashi N, et al. Nitric oxide, atrial natriuretic peptide, and cyclic GMP inhibit the growth-promoting effects of norepinephrine in cardiac myocytes and fibroblasts [J]. J Clin Invest, 1998, 101(4): 812-818.

[7] Vollinar AM, Kiemer AK. Immunomodulatory and cytoprotective function of atrial natriuretic peptide [J]. Crit Rev Immuno1, 2001, 21(6): 473-485.

[8] Lafontan M, Berlan M, Stich V, et al. Recent data on the regulation of lipolysis by catecholamines and natriuretic peptides [J]. Ann Endocrinol (Paris), 2002, 63(2 Pt 1): 86-90.

[9] Sonnenberg H, Cupples WA，de Bold AJ, et al. Intrarenal localization of the natriuretic effect of cardiac atrial extract [J]. Can J Physiol Pharmacol, 1982, 60(9): 1149-1152.

[10] Silberbach M, Roberts CT Jr. Natriuretic peptide signaling: molecular and cellular pathways to growth regulation [J]. Cell Signal, 2001, 13(4): 221-231.

[11] Schiebinger RJ，Cragoe EJ Jr. Ouabain. A stimulator of atrial natriuretic peptide secretion and its mechanism of action [J]. Circ Res, 1993, 72(5): 1035-1043.

[12] Lew RA, Baertschi AJ. Mechanisms of hypoxia-induced atrial natriuretic factor release from rat hearts [J]. Am J Physiol, 1989, 257 (1 Pt 2): H147-H156.

[13] Nishikimi T, Miura K, Minamino N, et al. Role of endogenous atrial natriuretic peptide on systemic heart and renal hemodynamics in failure rats [J]. Am J Physiol, 1994, 267 (1 Pt 2): H182-H186.

[14] Wada A, Tsutamoto T, Matsuda Y, et al. Cardiorenal and neurohumoral effects of endogenous atrial natriuretic peptide in dogs with severe heart failure using a specific antagonist for guanylate cyclase-coupled receptors [J]. Circulation, 1994, 89(5): 2232-2240.