歐毅超，馮展鵬，武廣森，張 源，包 赟，邱炳輝，劉亞偉，漆松濤*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510515)

三維結(jié)構(gòu)的研究對闡述組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)、毗鄰組織的解剖關(guān)系、細(xì)胞分子層面的生理功能有至關(guān)重要的作用。然而，因為光散射效應(yīng)和厚組織片成像困難等原因，在組織學(xué)研究時，通常將樣品制成薄切片，從平面觀察和描述細(xì)胞、組織的信息，導(dǎo)致了生物體三維結(jié)構(gòu)的信息缺失。曾有生物學(xué)家嘗試應(yīng)用陣列斷層掃描技術(shù)對切片成像進(jìn)行三維重建，但耗時耗力，效果有限[1]。因此研究者們設(shè)想在不切片和不損毀組織的前提下，進(jìn)行組織的立體成像，并且可對同一個樣品進(jìn)行多次成像。首先，限制的客觀條件是，組織過厚，一些組織中存在著色素，使組織有顏色。此外，研究者面對最困難的問題是，大多數(shù)生物組織為實質(zhì)不透光，這些特性削弱了組織塊成像的清晰度，也是觀察深層結(jié)構(gòu)的最大阻礙。

出于各種需求，研究者們在20世紀(jì)末便開展了許多組織透明化的嘗試。所有組織透明化技術(shù)的關(guān)鍵是如何使光透過樣品時與介質(zhì)的折射率相匹配，以減少光在組織中的不均勻散射?，F(xiàn)階段的方法大致可分為2大類：溶劑型和水基型透明化，前者如BABB、3DISCO、iDISCO[2]等；后者又分為單純浸泡法，如SeeDB[3]、FRUIT、TDE等；水化法，如Scale A2、Scale U2、CUBIC[4]等；水凝膠嵌入法，如CLARITY、PACT、PARS等。以上方法各有利弊，目前，在國內(nèi)開展組織透明化技術(shù)并不多，對這些透明方法的比較報道更鮮有報道。在此，我們分別從各類型中選取較為代表性的方法，iDISCO(immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs)、SeeDB(See Deep Brain)、CUBIC(clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis)、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC(the clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/ immunostaining compatible, tissue hydrogel-CUBIC)、Passive CLARITY(passive and the clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/ immunostaining compatible, tissue hydrogel)，共6個方法對大鼠腦組織塊透明化的效果進(jìn)行比較。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠14只，8～10周齡，體重220～240 g，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(粵)2011-0015]，大鼠腦組織取材于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院進(jìn)行[SYXK(粵)2015-0056]，并通過南方醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查[NFYY-2014-88].

1.2 主要試劑及儀器

生理鹽水； PBS粉末(Fisher公司，貨號BP399-1)；多聚甲醛粉末；甲醇；去離子水；鹽酸；氫氧化鈉；疊氮鈉；30%H2O2；DMSO；TritonX-100(Sigma公司)；肝素(Sigma公司，貨號H3393)；四氫呋喃(THF，Sigma公司，貨號186562)；二氯甲烷(Sigma公司，貨號270997)；二芐基醚(Sigma公司，貨號108014)；果糖；α-硫代甘油(Sigma公司)；SCALEVIEW-A2溶液(Olympus公司)；O.C.T.(Sakura公司)；四羥丙基乙二胺(Quadrol，Sigma公司)；尿素(Sigma公司)；三乙醇胺(Solarbio公司)；硅油(Sigma公司)；礦物油(Solarbio公司)；甘油；VA-044引發(fā)劑(WAKO公司，貨號VA-044)；丙烯酰胺(Sigma公司)；雙甲叉丙烯酰胺(Sigma公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；2,2’-硫代雙乙醇(Sigma公司，貨號166782)；硼酸(Sigma公司，B7901)；易氟烷。

涂硅帽玻璃細(xì)頸瓶(Thermo Fisher公司，貨號C326-0020)，低塵紙(Kimwipe公司)；真空干燥裝置；水平搖床；蹺板搖床；試管旋轉(zhuǎn)器；磁力加熱攪拌器；恒溫箱；pH計；動物吸入麻醉機(jī)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

14只SD雄性大鼠隨機(jī)分為7組：PBS組、iDISCO組、SeeDB組、CUBIC組、SCALEVIEW-A2組、CLARITY-CUBIC組、Passive CLARITY組，接受不同的透明化方法。

1.3.2 腦組織塊的準(zhǔn)備

除CLARITY-CUBIC組外，其余6組共12只 SD大鼠吸入麻醉后，經(jīng)心尖灌注含有肝素的生理鹽水(200 mg/500 mL)，待到大鼠體內(nèi)血液被置換完全，改用冰凍的4%多聚甲醛灌注固定，灌注完成后去除腦部皮膚及骨頭取出鼠腦，用大鼠腦模具冠狀切修整2 mm，然后每個鼠腦沿正中矢狀線對半切，每只大鼠取前、中、后大腦半球雙側(cè)可得6個腦組織塊，即12個組織塊每組，在4℃ 4%多聚甲醛浸泡保存?zhèn)溆谩LARITY-CUBIC方法組，先用生理鹽水灌注后，再繼續(xù)灌注水凝膠溶液，約200 mL每只(配方見后述)，取腦備用。

1.3.3 透明方法試劑的配備

iDISCO法所需配備的試劑有：50%甲醇(1體積無水甲醇與1體積0.01 mmol/L PBS混合)；80%甲醇(4體積無水甲醇與1體積0.01 mmol/L PBS混合)；100%甲醇；5% H2O2/20% DMSO/甲醇(1體積30% H2O2與1體積DMSO與4體積甲醇混合)；20% DMSO/甲醇(1體積DMSO與4體積無水甲醇混合)；0.2% PBST (1體積TritonX-100 與500體積0.01 mmol/L PBS混合)；50%四氫呋喃/H2O(1體積四氫呋喃與1體積雙蒸水混合)；80%四氫呋喃/H2O(4體積四氫呋喃與1體積去離子水混合)；100%四氫呋喃(THF)；二氯甲烷(DCM)；二芐基醚(DBE)。以上溶液室溫保存。

SeeDB法所需配備的試劑有：20%果糖(4 g果糖加去離子水至20 mL)；40%果糖(8 g果糖加去離子水至20 mL)；60%果糖(12 g果糖加去離子水至20 mL)；80%果糖(16 g果糖加去離子水至20 mL)；100%果糖(20 g果糖加去離子水至20 mL；SeeDB溶液(20.25 g果糖加5 mL去離子水)；SeeDB37(27 g果糖加5 mL去離子水)以上每份20 mL溶液均需加入100 μL α-硫代甘油以避免梅拉德反應(yīng)。以上溶液配備后短期內(nèi)使用。

CUBIC法所需配備的試劑有：80% Quadrol(125 g去離子水加入500 g Quadrol，加熱混合)；ScaleCUBIC-1(也稱為reagent-1，將125 g尿素與156 g 80% Quadrol在144 g去離子水中加熱攪拌，充分溶解后冷卻至室溫，再加入75 g TrionX-100同時攪拌，使用真空泵排氣處理30 min，壓力調(diào)至0.1 MPa，配成500 g reagent-1溶液)；1/2 reagent-1(reagent-1與去離子水1∶1混合)；ScaleCUBIC-2(也稱為reagent-2，將25 g蔗糖與12.5 g尿素在7.5 g去離子水中加熱攪拌，充分溶解后冷卻至室溫，再加入5 g三乙醇胺同時攪拌，使用真空泵排氣處理30 min，壓力調(diào)至0.1 MPa，配成50 g reagent-2溶液)；1/2 reagent-2(reagent-2與0.01 mmol/L PBS溶液1∶1混合)；浸泡混合油(1∶1混合礦物油與硅油)。以上溶液均可室溫存放，若出現(xiàn)強(qiáng)烈尿素氣味時應(yīng)重配溶液。

SCALEVIEW-A2法所需配備的試劑有：SCALEVIEW-A2溶液為商品制品；20%蔗糖(100 g蔗糖溶解至500 mL 0.01 mmol/L PBS中)。

CLARITY-CUBIC法所需配備的試劑有：4℃ 16% PFA溶液；VA-044溶液(125 mg VA-044引發(fā)劑溶解在26.25 mL去離子水，4℃保存)；4℃ 40%丙烯酰胺溶液；4℃ 2%雙甲叉丙烯酰胺溶液；0.1 mmol/L PBS溶液；水凝膠溶液(將26.25 mL VA-044溶液、16% PFA12.5 mL、40%丙烯酰胺5 mL、2%雙甲叉丙烯酰胺1.25 mL、0.1 mmol/L PBS 5 mL在冰上混合，配成50 mL溶液)；CUBIC透明液(將3.85 g尿素、3.85 g四羥丙基乙二胺在5.38 mL去離子水中加熱攪拌混勻，充分溶解冷卻室溫后加入2.31 g TritonX-100，配成10 g溶液)；85%甘油。以上溶液均需4℃保存。

Passive CLARITY法所需配備的試劑有：水凝膠溶液(各成分的終濃度：0.01 mmol/L PBS，4% PFA，4%丙烯酰胺，0.05%雙甲叉丙烯酰胺，0.25% VA-044引發(fā)劑)；透明液(各成分的終濃度：硼酸200 mmol/L，4% SDS)，以上溶液均需4℃保存。

1.3.4 透明化方法的步驟

iDISCO[2](甲醇處理法)：(1)甲醇預(yù)處理：取4% PFA固定的腦片，經(jīng)PBS漂洗2次，每次1 h，然后分別經(jīng)50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇梯度浸泡各1 h，更換100%甲醇浸泡1 h，再經(jīng)5% H2O2/20% DMSO/甲醇混合溶液漂白，4℃過夜。第二天，更換100%甲醇漂洗2次，每次1 h，再換20% DMSO/甲醇混合溶液漂洗2次，每次1 h，接著依次更換80%甲醇、50%甲醇、PBS漂洗，每次1 h，使用PBS再次漂洗1 h，最后放入0.2% PBST漂洗2次，每次1 h后備用。(2)組織透明化：經(jīng)預(yù)處理的腦片，分別放入50% THF 10 mL的玻璃瓶中，室溫過夜。第二天，更換80% THF/H2O混合溶液10 mL孵育1 h后，更換100% THF 10 mL孵育2次，每次1 h，最后用Kimwipe紙輕拭干殘留液體后，放入裝滿DCM的玻璃瓶中孵育。樣品沉底后再放入DBE溶液中至透明(抽真空排出氣體后，靜置2 h左右)，然后在DBE溶液中室溫保存。

SeeDB[3](標(biāo)準(zhǔn)法):取4% PFA固定后的腦片，PBS漂洗3次，每次10 min，每個組織塊分別依次置入20 mL的20%果糖、40%果糖、60%果糖孵育各4～8 h，再置入80%果糖，100%果糖20 mL孵育各12 h，最后置入20 mL SeeDB溶液孵育24 h，不超過48 h。然后放置入SeeDB37溶液，37℃孵育24 h。以上孵育過程均需在試管旋轉(zhuǎn)器上或翹板搖床上進(jìn)行。最后將組織塊浸泡在水或者在30%甘油中觀察。

圖1 幾種組織光學(xué)透明方法的實驗流程圖Fig.1 Schematic flow chart of clearing process by different tissue optical clearing protocols for rat brain tissues

CUBIC[4](簡單浸泡法)：取4% PFA固定的腦片，經(jīng)PBS漂洗2次，每次2 h以清洗殘余的PFA，腦組織塊分別置入8～10 mL的1/2 reagent-1溶液，在37℃搖蕩浸泡，3～6 h后棄液，馬上換等量reagent-1溶液于37℃下浸泡過夜。翌日，換等量的reagent-1在同等條件中浸泡，之后以每2 d更換一次reagent-1。待第7天結(jié)束，終止透明進(jìn)程，換PBS漂洗3次，每次2 h后，在PBS中浸泡過夜。第二天，棄剩少量PBS，放入真空箱中抽真空30 min以去除氣體。完成后將腦組織塊置入5 mL 1/2 reagent-2溶液，37℃浸泡6～24 h，至組織塊沉底后換5 mL reagent-2溶液，37℃過夜。翌日，再換一次5 mL reagent-2溶液備用。以上步驟均使用蹺板搖床孵育、漂洗。觀察前用Kimwipe去除殘余溶液，浸泡至混合油溶液中10 min至1 h。

SCALEVIEW-A2[5]：取4% PFA固定的腦片，放入20%蔗糖中，37℃浸泡24 h，再用OCT混合物包埋后放入-80℃冰箱。翌日，取出并待融化后用PBS漂洗干凈，重新用4% PFA室溫固定20 min。然后用15 mL SCALEVIEW-A2分別浸泡腦組織塊，每天換一次液，持續(xù)7 d，孵育過程均需在搖床上進(jìn)行。最后泡在新鮮SCALEVIEW-A2溶液中觀察。

CLARITY-CUBIC[6]：取經(jīng)水凝膠灌注的腦組織，分別置入15 mL水凝膠中，4℃過夜。翌日，棄10 mL水凝膠溶液，將剩余的5 mL液體與組織塊倒入5 mL管中，加水凝膠至略高出瓶口，再用封口膜封好放入37℃烘箱過夜。翌日，取出凝固的水凝膠與腦組織塊，用Kimwipe輕拭去除殘余的水凝膠，再用PBS漂洗4次共24 h后，放入5 mLCUBIC透明液中，在37℃烘箱中振蕩孵育3 d后，再用PBST漂洗6次共24 h以備用。最后浸泡至混合油溶液中觀察。

Passive CLARITY[7]：取4% PFA固定的腦片，分別置入40 mL水凝膠溶液中，在4℃搖床中孵育7 d。(1)聚合反應(yīng)步驟：孵育完畢，去除20 mL水凝膠后，將樣品與溶液置于真空箱內(nèi)，抽真空30 min后，在37℃水浴鍋里進(jìn)行3 h的聚合反應(yīng)，完成后用Kimwipe輕拭干凈。(2)去脂反應(yīng)：每個聚合樣品置入40 mL透明液中，45℃烘箱振蕩孵育，前7 天每天換液一次。以后在40℃烘箱震蕩孵育，每2～3 d換液一次，至透明，耗時4～6周。

以上6種方法實驗流程見圖1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同方法透明大鼠腦組織成像

如圖2所示，PBS處理的腦組織塊前后無明顯的改變。iDISCO方法處理的腦組織塊變得透明、勻稱、背后標(biāo)格清晰對稱無偏差，略成毛玻璃樣。SeeDB方法處理的組織與之前比較略有透光，背后標(biāo)格不清晰。CUBIC方法的處理相對其他各組最透明透光，皮層基本和背景一致，胼胝體和白質(zhì)纖維可肉眼觀察到，邊緣略不平整。SCALEVIEW-A2透明液處理的組織略透明，皮質(zhì)可隱約看到背后的標(biāo)格，而白質(zhì)基本不透光。而CLARITY-CUBIC與Passive CLARITY均有水凝膠在表面，腦組織相對透光，可見背后網(wǎng)格。

2.2 不同透明方法處理的腦組織塊大小改變及透明效果評估

透明度用灰度值(INT)表示，PBS為13.031±0.586，iDISCO 為6.447±0.574，SeeDB為11.690±0.909，CUBIC為2.318±0.986，SCALEVIEW-A2為8.118±1.026，CLARITY-CUBIC為8.591±0.384，Passive-CLARITY為4.198±0.182；與PBS組比較，除了SeeDB組差異無顯著性外(P=0.185)，其余各組均較PBS組有顯著性差異(P< 0.01)。使用LSD法比較，iDISCO分別與SeeDB、CUBIC有顯著性差異(P< 0.01)，SeeDB分別與CUBIC、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC，Passive-CLARITY有顯著性差異(P< 0.01)，CUBIC分別與SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC，Passive-CLARITY有顯著性差異(P< 0.01)。(圖3A)

經(jīng)透明化處理后，iDISCO組面積改變?yōu)?-30.02±2.39)%，SeeDB為(19.74±4.09)%, CUBIC為(14.7±3.92)%，SCALEVIEW-A2為(10.7±5.55)%，CLARITY-CUBIC為(23.01±4.19)%，Passive-CLARITY為(66.51±5.68)%，各組面積改變均較iDISCO組、Passive-CLARITY組有顯著性差異(P< 0.01)。(圖3B)

注：A: 不同方法的處理后組織透明度灰度值比較；B: 不同方法的處理后面積改變比較。P: PBS組; I: iDISCO組; S: SeeDB組; C: CUBIC組; SV: SCALEVIEW-A2組; CC: CLARITY -CUBIC組; PC: passive clarity組。與PBS組比較，*P< 0.01；iDISCO組比較，#P< 0.01；SeeDB組比較，?P< 0.01；CUBIC組比較，P< 0.01；Passive-CLARITY組比較，ξP< 0.01。圖3 不同透明化方法處理大鼠腦組織塊的透明度灰度值與面積改變Note.A: INT index. B: Changes of area after different treatments. P: PBS group.I: iDISCO group.S: SeeDB group.C: CUBIC group.SV: SCALEVIEW-A2 group.CC: CLARITY-CUBIC group.PC: passive CLARITY group. Compared with the PBS group, *P< 0.01. Compared with the iDISCO group, #P< 0.01. Compared with the SeeDB group，?P< 0.01. Compared with the CUBIC group, P< 0.01. Compared with the Passive-CLARITY group, ξP< 0.01.Fig.3 The INT index and area changes after processing with different optical tissue clearing methods on rat brain tissue blocks

3 討論

本研究討論了不同組織透明化方法的效果。現(xiàn)有的組織透明化方法大概可分為2大類：溶劑型與水基型透明化，前者由1914年Spalteholz[8]的方法改進(jìn)而來，常用的方法有BABB、3DISCO、iDISCO等，其中iDISCO為3DISCO的改良，同時適用于組織的免疫熒光染色。簡而言之，溶劑型透明化有主要兩個步驟：第一步是用脂溶劑脫水，第二步用不同的脂溶劑匹配已經(jīng)脂劑脫水組織折光率，使之一致，達(dá)到透明化效果[9-11]。水基型透明化方法又可分為(1)簡單沉浸法；(2)水化法；(3)水凝膠嵌入法等。此透明法主要是圍繞以下核心機(jī)制：(1)被動沉浸在溶液中直至折射率與組織匹配；(2)水化反應(yīng)后去除脂質(zhì)，以降低折射率，或者(3)主動或被動去除脂質(zhì)后，沉浸在折光率匹配的介質(zhì)中(refractive index matched solution, RIMs)。簡單沉浸法包括：Sucrose、FocusClear、ClearT[12]、ClearT2、SeeDB、FRUIT、TDE[13]等，水化法包括：Scale A2、Scale U2、CUBIC，以及商品化的SCALEVIEW-A2等。水凝膠法包括有始創(chuàng)的CLARITY[14-15]，和后續(xù)的PACT/PARS-CLARITY，Passive-CLARITY，還有改良的CLARITY-CUBIC方法等，近幾年以水凝膠法開發(fā)的新透明化方法不斷增多。在本次實驗中，以透明周期、透明效果、透明后組織面積改變等指標(biāo)進(jìn)行研究，對四類的組織透明化方法進(jìn)行比較。

在本研究中，溶劑型iDISCO方法可在1周內(nèi)完成，水基型中單純沉浸(SeeDB)及水化法(SCALEVIEW-A2、CUBIC)透明周期在1～2周之間，而passive CLARITY方法則需耗時4～6周。透明周期不同的主要原因在于透明原理的差異。溶劑型iDISCO法是通過脂溶劑脫水后，繼而利用脂溶劑匹配已脫水的組織塊，使其達(dá)到折光率一致，針對性強(qiáng)，耗時短。水基型透明法中單純沉浸(SeeDB)及水化法(SCALEVIEW-A2、CUBIC)是通過被動沉浸在溶液或者水化去脂，以降低折射率，最后浸泡在折光率相匹配的介質(zhì)中達(dá)到透明效果，用時約在1～2周。而Passive-CLARITY及CLARITY-CUBIC方法都是基于水凝膠嵌入CLARITY[15]方法改進(jìn)而來。CLARITY方法的局限性在于電泳儀的使用，與一般的蛋白電泳儀不同，主動電泳去脂有特殊的要求，電泳的電壓把握不好便會破壞組織，時間過短或過長會導(dǎo)致透明不徹底和過度膨脹，技術(shù)的操控性是所有透明化中最難開展的，所以本實驗并無對此法進(jìn)行探討，而是選擇了水凝膠的被動透明(Passive-CLARITY)和改良法(CLARITY-CUBIC)。CLARITY-CUBIC法在組織經(jīng)過水凝膠灌注之后，通過高濃度的洗滌劑去除組織中脂質(zhì)，從而縮短了組織透明的時間，但這也導(dǎo)致了大量蛋白丟失的問題。而在Passive CLARITY方法中，腦組織在經(jīng)過水凝膠嵌入、聚合反應(yīng)后，使用被動去脂的方法(8% SDS洗滌劑等)，達(dá)到透明化的效果。這種去脂方法較為溫和，對組織樣品蛋白的破壞較小，但是耗時較長。

通過對組織透明化后的灰度分析，我們發(fā)現(xiàn)透明效果最好的是CUBIC法，其次為iDISCO及Passive-CLARITY法，SCALEVIEW-A2及CLARITY-CUBIC法的透明效果尚可，而SeeDB在本研究中未能實現(xiàn)透明效果。水基型水化-透明化CUBIC法是通過水化反應(yīng)，對樣品去脂同時降低折射率。使用尿素用以穿透和變性組織，水合作用減少了總體折光率降至1.38，最后利用混合油(1∶1混合礦物油與硅油)匹配折光率到達(dá)很好的透明效果[4]。同為水化法的SCALEVIEW-A2是一步法透明，且SCALEVIEW-A2溶液較稀，折光率較小，可能透明效果較CUBIC差的因素之一。溶劑型iDISCO法通過脂溶性溶液脫水常會使折光率大于1.5(遠(yuǎn)高于脂性溶液與水)，在脂性脫水后緊接著浸泡另一組脂性溶液，并且選擇的溶液具有均勻嵌合到組織中的特性，以達(dá)到透明效果[2]。Passive CLARITY亦可以到達(dá)較好的透明效果，但是耗時長。而單純沉浸的SeeDB法通過組織樣品置入一系列水溶液，包括可溶的，高折射率的化學(xué)劑使之逐漸透明，主要試劑有蔗糖、果糖、甘油、2,2’-硫二甘醇(TDE)、甲酰胺等。這種被動透明方法相對其他透明方法效果較差，在本實驗中也證實了這一點，灰度值分析與PBS組差異無顯著性，所以此方法較適宜用在相對較薄的小樣品中。

組織透明化產(chǎn)生的初衷是為了立體地觀察組織的三維結(jié)構(gòu)，但是我們發(fā)現(xiàn)在組織透明化的過程中，腦組織會出現(xiàn)皺縮或者膨脹的現(xiàn)象，這種形態(tài)的變化可能會改變組織內(nèi)部原本的三維結(jié)構(gòu)，不利于后續(xù)研究，因此本研究中探討了不同透明化方法后組織面積改變的差異。我們發(fā)現(xiàn)溶劑型iDISCO法處理后組織皺縮，而經(jīng)水基型透明化法后組織均出現(xiàn)不同程度的膨脹，其中Passive-CLARITY法膨脹最為明顯。這是因為溶劑型透明法通過脂溶性溶液脫水導(dǎo)致組織皺縮，得到高折光率的透明組織樣品。在我們的研究中測量出iDISCO是幾種方法中縮小最明顯的(平均縮小了30%)，組織也變得硬實，但是透明效果的穩(wěn)定性很好，組間差異無顯著性。而水基型透明法中是基于水環(huán)境中透明的，因此組織會出現(xiàn)不同程度的膨脹，其中水凝膠嵌入法的組織膨脹較為明顯，由于CUBIC法改進(jìn)使用兩步法來透明組織，中間有一步PBS目的便是為了減少組織的膨大，第二步透明使用了高濃度的蔗糖，脫水的同時加速透明進(jìn)程。因此CLARITY-CUBIC法膨脹率較Passive-CLARITY法明顯減少(P< 0.01)。

在本次研究中，最優(yōu)良的透明效果為CUBIC，雖然用時較長，但是效果穩(wěn)定，組織變形小，試劑毒性小，也容易配制。而iDISCO也不失為備用的方法。

透明組織只是透明化成像技術(shù)的第一步，整個技術(shù)還需要探討以下問題：(1)適用于帶熒光蛋白標(biāo)簽的腦組織或者免疫熒光染色的方法。根據(jù)現(xiàn)有的研究，溶劑型透明3DISCO與iDISCO的報道是熒光會在幾天內(nèi)淬滅[16]。水基型中簡單沉浸法(如SeeDB)最大的優(yōu)點是保持各種組織的熒光的兼容性，包括了脂性標(biāo)記染料如神經(jīng)示蹤劑Dil等。水化法中有報道Scale A2 及CUBIC溶液中含有高濃度的尿素及Triton用于去脂和洗滌，這過程會導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量降解(24%～41%)和降低熒光水平[4]。水凝膠嵌入法通過應(yīng)用水凝膠替代細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，充分與組織細(xì)胞組分，包括蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、DNA等生物信息物質(zhì)結(jié)合，因此在后續(xù)的熒光標(biāo)記應(yīng)用中更具優(yōu)勢。(2)透明化技術(shù)可應(yīng)用的組織類別。目前透明化技術(shù)主要應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)中，有報道水凝膠CLARITY法可以應(yīng)用在小鼠外周胃、小腸、心、肺、腎甚至腫瘤組織等，另外，在一些研究中可能需要對肌肉、骨頭、腦組織等結(jié)構(gòu)的聯(lián)合觀察，這些可應(yīng)用動物全身透明化的方法值得深入探討。(3)圖像的捕捉，也是很關(guān)鍵的因素，目前有共聚焦、雙光子顯微鏡和光層掃顯微鏡(light-sheet microscope LSFM)[17-20]，主要是物鏡的工作距離和時間、掃描深度等技術(shù)問題影響成像深度和體積，目前來說，LSFM成像是透明化組織最理想的拍攝工具。(4)折光率匹配問題，原理上主要是球面光行差造成的成像減少，原因是物鏡與組織內(nèi)各種折光率不匹配[21]。(5)透明液的獲取及處理，如iDISCO法很多試劑是有毒的，也可以溶解物鏡的膠聚合物，棄液需要嚴(yán)格按照當(dāng)?shù)亟】岛桶踩ㄒ?guī)執(zhí)行毫無疑問，不久的將來，將會發(fā)明和改進(jìn)更多的透明化和成像的方法，隨著這些技術(shù)的發(fā)展，商業(yè)化試劑也會更加穩(wěn)定高效，適用于各種物鏡和顯微鏡。另外也會促進(jìn)新的適用于透明化的抗體、熒光蛋白保護(hù)劑、RIMs等大規(guī)模的應(yīng)用，使得透明化成像技術(shù)成為形態(tài)學(xué)研究的一個必備的方法。

通過本次比較實驗我們可知，除SeeDB外，iDISCO法、CUBIC法、SCALEVIEW-A2法、CLARITY-CUBIC法、passive CLARITY法均能達(dá)到透明效果，CUBIC方法在大鼠腦組織塊的透明效果優(yōu)于其他各組，用時也相對適中，iDISCO處理后面積縮小較為明顯，透明效果次之，但時間最短，可作為備選方案。其余的，SCALEVIEW-A2雖然步驟最簡單，但效果欠佳，CLARITY-CUBIC和passive-CLARITY法均使用水凝膠，對腦組織中部的觀察影響不大，如果研究關(guān)注的正好是邊緣部位，此時因有水凝膠的殘留，可能會影響觀察，同時，Passive-CLARITY經(jīng)過長期處理后膨脹最為明顯。本研究初步探討了各種透明法的效果和特征，為后續(xù)的光透明化三維成像提供了一些實踐經(jīng)驗，因此，仍有必要進(jìn)一步比較探討不同透明化方法的適用范圍和成像效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] Micheva KD, Smith SJ. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits [J]. Neuron, 2007, 55(1): 25-36.

[2] Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging [J]. Cell, 2014, 159(4): 896-910.

[3] Ke MT, Fujimoto S, Imai T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction [J]. Nature Neurosci, 2013, 16(8): 1154-1161.

[4] Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging [J]. Nat Protoc, 2015, 10(11): 1709-1727.

[5] Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain [J]. Nat Neurosci, 2011, 14(11): 1481-1488.

[6] Liang H, Schofield E, Paxinos G. Imaging serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the CLARITY/CUBIC technique [J].J Vis Exp, 2016, (108): 53673.

[7] Roberts DG, Johnsonbaugh HB, Spence RD, et al. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY [J]. J Vis Exp, 2016, (112).

[8] Spalteholz W. über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pr?paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang [M]. 1914.

[9] Becker K, Jahrling N, Saghafi S, et al. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains [J]. PLoS One, 2012, 7(3): e33916.

[10] Peters W. Methoden zur Herstellung von Aufhellungpr?paraten [J]. Zoologischer anzeiger, 1961, 167: 233-240.

[11] Erturk A, Becker K, Jahrling N, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO [J]. Nat Protoc, 2012, 7(11): 1983-1995.

[12] Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. Clear T: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue[J]. Development, 2013, 140(6): 1364-1368.

[13] Staudt T, Lang M C, Medda R, et al. 2,2′-Thiodiethanol: A new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy [J]. Microsc Res Techn, 2007, 70(1): 1-9.

[14] Tomer R, Ye L, Hsueh B, et al. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues [J]. Nat Protoc, 2014, 9(7): 1682-1697.

[15] Chung K, Wallace J, Kim S, et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems [J]. Nature, 2013, 497(7449): 332-337.

[16] Ertürk A, Mauch C P, Hellal F, et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury [J]. Nat Med, 2011,18(1): 166-171.

[17] Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope [J]. Scanning, 1988, 4(10): 128-138.

[18] Theer P, Denk W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy [J]. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis, 2006, 23(12): 3139-3149.

[19] Theer P, Hasan MT, Denk W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier [J]. Optics Letters, 2003, 28(12): 1022-1024.

[20] Dodt HU, Leischner U, Schierloh A, et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain [J]. Nat Methods, 2007,4(4): 331.

[21] Hell S, Reiner G, Cremer C, et al. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index [J]. 1993, 169(3): 391-405.