張宏霞，呂靜薇，張北月，董黎明，李 由，陳曉萍，陳善廣*，劉新民,*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 3.中國航天員科研訓(xùn)練中心人因工程重點實驗室，北京 100094； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

明暗箱實驗(light/dark box test，LDB)，是一種使用較為廣泛的行為學(xué)檢測方法[1-2]，用來篩選和評價抗焦慮藥物的活性，同時也可用于焦慮癥病理機(jī)制的研究[3]。因明暗箱實驗具有操作簡單且不需要事先訓(xùn)練動物[4]的優(yōu)點，自1980年Crawley等[5]建立至今，已經(jīng)成為經(jīng)典的評價嚙齒類動物狀態(tài)性焦慮和特質(zhì)性焦慮行為學(xué)方法[6]。明暗箱利用嚙齒類動物喜歡探究新奇環(huán)境，但又因厭惡明室中亮光而被迫退卻，由此形成矛盾沖突狀態(tài)，使穿箱次數(shù)減少?？菇箲]藥物可顯著增加鼠的穿箱次數(shù)以及在明室時間[7]。

作者在抗焦慮中藥藥理實驗研究過程中，參考國內(nèi)外已有的抗焦慮研究方法，結(jié)合醫(yī)學(xué)動物行為學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、機(jī)械工程學(xué)，利用計算機(jī)視頻采集技術(shù)和圖像分析技術(shù)，研制了明暗箱實驗圖像分析處理系統(tǒng)，實現(xiàn)了明暗箱實驗圖像分析系統(tǒng)的高自動化、提取信息量大、指標(biāo)敏感而豐富、圖像信息形象而生動。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性 Wistar大鼠100只，體重220～250 g，6～7周齡，由北京維通利華實驗動物公司提供[SCXK(京)2016-0011]。全部動物實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動物房進(jìn)行[SYXK(京) 2013-0023]。動物適應(yīng)環(huán)境5 d后進(jìn)行實驗，實驗期間自由供給標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔自來水，12 h∶12 h(光∶暗)，室溫22℃～25℃，濕度條件為(55±10)%。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要儀器

灰白色鋁合金材料、防反光的黑色糙面金屬材料、電路控制模塊(固態(tài)繼電器、電源、轉(zhuǎn)換器等)、發(fā)光二極管、工業(yè)攝像機(jī)(VS-250DH，分辨率752×582)、鏡頭(AFT-VS0410ZM)，鏡頭可變焦3.5～8 mm)、紅外截止濾鏡、視頻線、CAN現(xiàn)場總線，CAN現(xiàn)場總線接口卡(KPCI-8110)、計算機(jī)主機(jī)(9寸顯示屏，雙核，Intel i5 處理器，Windows 7系統(tǒng)，內(nèi)存容量4 G，硬盤內(nèi)存 1 TB，三個以上 USB 接口，刻錄光驅(qū))、顯卡、單片機(jī)MCU、圖像采集卡(微視E413,總線數(shù)據(jù)傳輸速率可達(dá)250 MByte/S, 9 bit 的視頻 A/D, 8路的TTL輸入/輸出控制)、采樣速率每秒25幀、打印機(jī)。

1.3 大、小鼠明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)的建立

1.3.1 硬件的研制

明暗箱實驗系統(tǒng)采用攝像視頻跟蹤技術(shù)識別目標(biāo)，獲取動物在明暗箱中活動情況。明暗箱硬件由測試箱、CAN現(xiàn)場總線、工業(yè)攝像機(jī)、圖像采集卡、電路控制模塊等組成。大鼠明暗測試箱尺寸為：61 cm × 46 cm×100 cm(長×寬×高)，小鼠明暗測試箱尺寸為：40 cm ×15 cm ×100 cm(長×寬×高)。明暗測試箱為灰白色鋁合金的封閉測試箱體(1)，箱體內(nèi)部用隔板(4)分隔成明暗兩室，明室頂部裝有白光燈，照度可調(diào)為0到1200 lux，暗室照度為2 lux，隔板下方有一小門(8)相通。測試箱頂部為控制電路板(2)，頂部中間位置安裝有攝像頭(3)，攝像頭上裝有紅外截止濾鏡，側(cè)面裝有紅外背景光源(7)(波長850 nm，側(cè)面平行照射，安裝于 2 倍于老鼠身體高度的位置[8]，高度約為(7～10 cm)，底部為不銹鋼柵(9)，鋼柵下方有用于收集動物的排泄物的活動抽屜(10)。CAN現(xiàn)場總線(11)接收軟件發(fā)送的指令，開啟紅外光，工業(yè)攝像機(jī)(3)實時采集明暗箱測試儀中動物的活動情況，圖像采集卡將采集到的模擬信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，軟件對傳送的數(shù)字信號進(jìn)行處理分析。明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)見圖1。

注：(1)測試箱體；(2)控制電路；(3)攝像頭；(4)隔板；(5)觀察窗；(6)門；(7)紅外燈陣列；(8)通道；(9)鋼柵；(10)糞便收集板；(11)CAN現(xiàn)場總線；(12)電源線；(13)實驗軟件系統(tǒng)。圖1 明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)示意圖Note.(1)Light/dark box,(2)Circuit,(3)Cameras,(4)Baffle plate,(5)Observation window,(6)Door,(7)Infrared lamp,(8)Corridor,(9)Grid,(10)Fecal collection plate,(11)Controller area network,(12)Power line,(13)Software.Fig.1 Schematic diagram of the structure of the computeraided-controlling and image analysis system for light/dark box test

1.3.2 軟件的研制

明暗箱實驗系統(tǒng)軟件利用Microsoft Visual C++6.0編程，可用于Windows 7、Windows XP操作系統(tǒng)，采用閾值分割法識別明暗箱中的動物，邊緣法計算動物的質(zhì)心并跟蹤動物的運動軌跡，扣除“本底噪音”方式[8]以及閾值法[9]，剔除多種噪聲。其中明暗箱實驗軟件利用E413采集卡的SDK開發(fā)了視頻采集模塊，實現(xiàn)對明暗箱中大、小鼠行為表現(xiàn)的準(zhǔn)確采集與分析；加入Open CV開發(fā)包，實現(xiàn)高效的標(biāo)準(zhǔn)化圖像處理；研制直方圖均衡化圖像增強(qiáng)方法，實現(xiàn)了圖像自動二值化功能、基于對話框的手動二值化功能和大、小鼠輪廓的全自動提取和質(zhì)心計算等功能。明暗箱實驗實時分析處理系統(tǒng)圖像處理流程，參見圖2。

注：(A)背景圖像取偶行；(B)實時圖像取偶行；(C)平滑；(D)相異/相減；(E)設(shè)置ROI；(F)二值化；(G)形態(tài)學(xué)；(H)掩碼；(I)提取輪廓；(J)找最大輪廓求質(zhì)心；(K)取消ROI；(L)對兩只老鼠分別進(jìn)行。圖2 明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)圖像處理流程N(yùn)ote.(A) Background image. (B) Real-time image. (C) Smoothing. (D) Subtraction. (E) Set ROI. (F) Binary threshold. (G) Morphology. (H) Mask image. (I) Extract contours. (J) Find the longest contour and get the mass center. (K) Unset ROI. (L) For each of the two mice.Fig.2 A diagram of the software of the computer-aided-controlling and image analysis system

明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)軟件由實驗方案、參數(shù)設(shè)置、實驗控制、數(shù)據(jù)分析與軌跡回放4大功能模塊組成。實驗方案：實驗時間、實驗名稱、動物品系、藥品名稱、動物分組等實驗信息。實驗設(shè)置：包括任務(wù)參數(shù)和實驗參數(shù)。任務(wù)參數(shù):實驗保存目錄、實驗名稱、操作人員等基本信息；參數(shù)設(shè)置：包括實驗階段、適應(yīng)時間、實驗時間、明暗區(qū)域比例的調(diào)節(jié)、灰度閾值的設(shè)置、相機(jī)提取閾值的改變等。實驗控制：實驗流程控制、實驗條件信息的顯示、動物活動視頻實時監(jiān)控與指標(biāo)的實時顯示。點擊實驗開始后，實驗系統(tǒng)自動識別動物，記錄動物位置的變化，提取得到帶時間坐標(biāo)的多維活動軌跡，并根據(jù)實驗條件，自動控制實驗流程。數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)保存、查看及重新處理。實驗結(jié)束后實驗人員可根據(jù)需求，選擇分析的實驗數(shù)據(jù)、行為學(xué)指標(biāo)以及可提取動物的圖像信息。實驗數(shù)據(jù)自動將結(jié)果保存為Excel文件。該軟件可提取26項直觀、科學(xué)的行為學(xué)指標(biāo)信息。其中包括：入明/入暗潛伏期、入明/入暗次數(shù)、穿箱次數(shù)、明室(暗室)時間等基本的評價指標(biāo)；運動時間、靜息時間、明室/暗室運動時間、明室/暗室靜息時間、總路程、明室/暗室路程、運動速度等其余判斷的指標(biāo)。同時該軟件可實時提取動物的多種圖像信息，包括視頻圖像、軌跡圖、熱點圖以及軌跡熱點復(fù)合圖等。明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)軟件軌跡熱點圖，見圖3。

明暗箱實驗圖像分析處理系統(tǒng)軟件界面采用結(jié)構(gòu)化、模塊化的設(shè)計風(fēng)格，操作簡潔方便，由圖像顯示區(qū)、參數(shù)設(shè)置控制區(qū)、實時結(jié)果輸出區(qū)三部分構(gòu)成。明暗箱實驗圖像分析處理系統(tǒng)軟件界面圖，參見圖4。

圖3 明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)軌跡熱點圖Fig.3 Diagram of trajectory and hot spot map of the computer-aided-controlling and imageanalysis system for the light/dark box test

圖4 明暗箱實驗圖像分析處理系統(tǒng)軟件界面圖Fig.4 Software interface of the computer-aided-controlling and image analysis system for light/dark box test

1.4 明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)驗證

1.4.1 明暗環(huán)境的驗證

雄性 40只Wistar大鼠，隨機(jī)分為兩組：A組(明室無燈組)20 只；B組(明室有燈組)20只。在測試房適應(yīng)1 h，進(jìn)行明暗箱實驗實驗，歷時1 d，每天 1 次，每次5 min，均于當(dāng)日 8:00～12:00 am進(jìn)行。實驗時打開紅外背景燈，實驗人員通過視頻監(jiān)控實驗過程，同時錄制視頻以提高人工記錄的準(zhǔn)確度。明室燈光照度為400 lux，暗室照度為2 lux。實驗中 A組關(guān)閉明室白光燈，B組則開啟明室白光燈，所有動物均背朝通道放入明室位置[10]，用秒表記錄動物在明室和暗室停留時間，以及記錄穿箱次數(shù)。

1.4.2 運動閾值的確認(rèn)

雄性 Wistar大鼠40只，在測試房適應(yīng)1 h后，進(jìn)行明暗箱實驗。實驗在一天內(nèi)完成，首先打開明暗箱計算機(jī)圖像實時分析處理系統(tǒng)，開啟明室內(nèi)白光燈(明室燈光照度為400 lux[5,11]，暗室照度為2 lux)，設(shè)置實驗時間為5 min。將動物背朝通道，放入明室內(nèi)，實驗過程中，人工記錄動物的運動時間(以動物四肢移動作為判斷其運動的標(biāo)準(zhǔn))，同時軟件根據(jù)不同的運動閾值(運動閾值取9、18、27、36、45、54 cm/s)，分析得到不同的運動時間。實驗后，將人工記錄的運動時間與軟件記錄的運動時間進(jìn)行相關(guān)性分析[12]，確定最佳的運動閾值。

1.4.3 指標(biāo)可靠性驗證

雄性 Wistar大鼠20只，在測試房適應(yīng)1 h后，進(jìn)行明暗箱實驗。實驗歷時1 d，打開明暗箱計算機(jī)圖像實時分析處理系統(tǒng)，開啟明室白光燈(明室燈光照度為400 lux，暗室照度為2 lux)，設(shè)置實驗時間為5 min，將動物背朝通道門放入明室，允許其在明暗室內(nèi)自由活動，檢測5 min內(nèi)動物穿箱次數(shù)、入暗次數(shù)、明室時間以及暗室時間等指標(biāo)，并將人工記錄數(shù)據(jù)與軟件分析結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4.4 明暗箱實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)的應(yīng)用

雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為兩組：A 組(正常組為明室無燈組)，20 只；B 組

(模型組為明室有燈組)，20只。在測試房適應(yīng)1 h，進(jìn)行明暗箱實驗實驗，歷時1 d，每天1次，每次5 min，均于當(dāng)日 8:00～12:00 am進(jìn)行。實驗時打開紅外背景燈，明室燈光照度為400 lux，暗室照度為2 lux，速度閾值設(shè)置為18 cm/s。實驗中 A 組關(guān)閉明室白光燈，B 組則開啟明室白光燈，所有動物均背朝通道放入明室，計算機(jī)軟件記錄動物在明室和暗室運動時間、運動路程等基本活動情況。動物來源同1.4.1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 明暗環(huán)境的驗證

動物從明室放入，檢測5 min，實驗結(jié)果表明:同明室無燈組相比，明室有燈組的穿箱次數(shù)顯著減少(P< 0.05)、明室有燈組的明室時間顯著減少(P< 0.01)、暗室時間顯著增加(P< 0.05)，且暗室時間為總時間的79.4%。結(jié)果如表1所示。

表1 明暗環(huán)境驗證結(jié)果Tab.1 Results of the environment check

注：與明室無燈組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the lit area without light group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表2 大鼠明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)人工記錄與計算機(jī)記錄的運動時間相關(guān)性Tab.2 Correlation of movement time of the rats collected by the computer and manual recording system in the light/dark test

注：與人工記錄的數(shù)據(jù)相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the manual record，*P< 0.05，**P< 0.01.

2.2 運動閾值的確認(rèn)

運動閾值為 9、18、27、36、45、54 cm/s 時，人工計時與明暗箱測試軟件的Pearson相關(guān)系數(shù)見表2。當(dāng)運動閾值為18 cm/s時，人機(jī)相關(guān)系數(shù)最高，為0. 996，差異有顯著性。之后進(jìn)行了多批次的實驗驗證，結(jié)果類似，證明明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)準(zhǔn)確、客觀的反映了動物在明暗箱中的活動情況。如表2所示。

2.3 指標(biāo)可靠性驗證

如表3所示，穿箱次數(shù)的人機(jī)相關(guān)性系數(shù)是0.998(P< 0.01)、明室時間的人機(jī)相關(guān)性系數(shù)是0.998(P< 0.01)、暗室時間的人機(jī)相關(guān)性系數(shù)是0.994(P< 0.01)、入明次數(shù)的人機(jī)相關(guān)性系數(shù)是0.997(P< 0.01)、入明潛伏期的人機(jī)相關(guān)性系數(shù)是0.998(P< 0.01),差異均有顯著性，與人工記錄值高度相關(guān)。結(jié)果見表3。

2.4 明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)的應(yīng)用

如表4所示，模型組(明室有燈組)、正常組(明室無燈組)兩組的運動時間、明(暗)室的平均速度差異均無顯著性，模型組的自主活動未受到影響。與正常組，模型組的穿箱次數(shù)(P< 0.01)、明室時間(P< 0.01)、明室運動總時間(P< 0.01)、明室運動路程(P< 0.01)顯著減少；入明潛伏期(P< 0.01)、暗室運動時間(P< 0.01)、暗室運動路程(P< 0.01)度顯著增加。同時軌跡熱點圖也可生動形象的表明此結(jié)果。結(jié)果見表4、圖5。

表3 大鼠明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)各指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation of basic indexes of the computer-aided-controlling and image analysis system for light/dark box test of the rats

注：與人工記錄的數(shù)據(jù)相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the manual record，*P< 0.05，**P< 0.01.

表4 兩組大鼠在明暗箱實驗中各指標(biāo)的比較Tab.4 Comparison of the indexes of the light/dark box text in the two rat groups

注：與正常組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

注：(A)空白組；(B)模型組。圖5 大鼠的明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)軌跡熱點圖Note.(A)Control group.(B)Model group.Fig.5 Trajectory diagram and hot spot map of the computer-auto-controlling and analysis system for light/dark box test of the rats

3 討論

明暗箱是抗焦慮藥物篩選以及焦慮癥病理機(jī)制研究中評價嚙齒類動物的經(jīng)典實驗方法[13-14]。結(jié)合醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、機(jī)械工程學(xué)等多學(xué)科優(yōu)勢，利用計算機(jī)視頻采集技術(shù)和圖像分析技術(shù)，提供了一種自動化程度高、重復(fù)性好、提取信息量大、指標(biāo)敏感性強(qiáng)、圖形信息形象而生動的大、小鼠明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)。

安靜、穩(wěn)定的實驗環(huán)境是行為學(xué)實驗結(jié)果可靠的先決條件。明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)采用封閉的箱體，紅外燈作為背景光源，白熾燈作為明室光源，模擬了自然環(huán)境，又對實驗環(huán)境進(jìn)行了嚴(yán)格的控制。經(jīng)過多批次的實驗研究表明，暗室時間大于總時間的70%，表明明暗環(huán)境成立，此結(jié)果也與文獻(xiàn)報導(dǎo)相一致[5]。明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)利用圖像處理、數(shù)據(jù)挖掘等技術(shù)提取約26項指標(biāo)。評價指標(biāo)體系從時間、位置、速度和路程等幾個方面全面而系統(tǒng)的提取動物的活動信息。對實驗系統(tǒng)所提取的指標(biāo)進(jìn)行人機(jī)相關(guān)性驗證，是儀器研發(fā)最重要和最基本的工作[15-19]。經(jīng)過大量的實驗研究表明，當(dāng)運動閾值為 18 cm/s 時，計算機(jī)與人工獲取的運動時間高度吻合，人機(jī)相關(guān)系數(shù)達(dá)r>0.99。同時穿箱次數(shù)、明室時間、暗室時間、入明時潛伏期的人機(jī)相關(guān)系數(shù)r>0.99，計算機(jī)所采集的數(shù)據(jù)客觀、可靠。 實驗室將采用不同品系的大鼠和小鼠、不同的動物模型對明暗箱實驗系統(tǒng)所提取出的大量行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期建立更加準(zhǔn)確的指標(biāo)評價體系。

明暗箱實驗是經(jīng)典的焦慮動物模型[6,20-22]。穿箱次數(shù)、明室時間、入明潛伏期等是明暗箱實驗中評價動物狀態(tài)的重要指標(biāo)參數(shù)[11,24-25]。用明暗箱模型組與正常組大鼠進(jìn)行比較，結(jié)果表明，同正常組相比，運動時間、明(暗)室的平均速度無顯著性差異。穿箱次數(shù)、明室時間、明室運動總時間、明室運動路程顯著減少。入明潛伏期、暗室運動時間、暗室運動路程度顯著增加。同時系統(tǒng)實時提取的視頻圖像、軌跡圖以及熱點圖等圖像信息也豐富生動的了描述了動物的焦慮狀態(tài)和自主活動狀態(tài)。因此本系統(tǒng)的所獲的這些指標(biāo)與經(jīng)典明暗箱模型的特點高度吻合[14]。

綜上所述，該明暗箱圖像分析處理系統(tǒng)為動物行為學(xué)研究提供了一套自動化程度高、獲取信息量大、人機(jī)數(shù)據(jù)高度相關(guān)、指標(biāo)客觀靈敏的分析處理系統(tǒng)，可推廣用于抗焦慮藥物的篩選以及焦慮癥病理機(jī)制的研究。

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